تاثیر قارچ Piriformospora indica بر صفات مورفوفیزیولوژیک گیاه تربچه (Raphanus raphanistrum L.) در شرایط تنش فلزات سنگین

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 مهندسی تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ملایر، ملایر، ایران

چکیده

چکیده
اهداف: قارچ Piriformospora indica علاوه بر تحریک رشد و نمو گیاه میزبان سبب ایجاد مقاومت به تنش‌های غیرزیستی نظیر تنش فلزات سنگین می‌شود. بررسی تاثیر قارچ اندوفیت P. indica بر برخی خصوصیات مورفوفیزیولوژیک گیاه تربچه و همچنین مقاومت به تنش فلزات سنگین از اهداف این پژوهش است.
 
مواد و روش­ها: این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ملایر انجام شد.  تیمارهای آزمایش شامل 3 نوع فلز سنگین (روی، نیکل، سرب و شاهد) و 3 تیمار قارچی (تلقیح با اسپور، تلقیح با میسیلیوم و عدم تلقیح) بودند. خصوصیات مورد بررسی شامل وزن خشک اندام هوایی، محتوای نسبی آب، رنگیزه های فتوسنتزی، نشت یونی، کربوهیدرات کل محلول، پروتئین و پرولین بود.
 
یافته­ها: نتایج نشان داد طی تنش، فلزات سنگین کاهش معنی‌داری در وزن خشک، محتوای نسبی آب، کلروفیل، کاروتنوئید، میزان کربوهیدرات و پروتئین ایجاد کرد؛ در حالیکه تلقیح با اسپور و میسیلیوم قارچ بر صفاتی نظیر پرولین، کربوهیدرات و پروتئین اثر معنی‌داری داشت و باعث افزایش این صفات و کاهش تاثیرات منفی فلزات سنگین شد. تنش فلزات سنگین با افزایش نشت یونی باعث ناپایداری غشاء گردید اما تلقیح با قارچ خصوصا اسپور میزان نشت یونی ناشی از پراکسیداسیون لیپیدها را پائین آورد.
 
نتیجه­گیری: کاربرد روش‌های زیستی می‌تواند نقش مهمی در مقابله با اثرات سمی فلزات سنگین داشته باشد. با توجه به تکثیر قارچ P. indica بر روی محیط کشت مصنوعی و نتایج بدست آمده، امکان استفاده از آن به عنوان یک کود زیستی در اصلاح خاک­های آلوده به فلزات سنگین قابل بررسی است.
 
 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of fungus Piriformospora indica Effects on Some Morphophysiological Traits of Radish under Heavy Metal Stress

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Izadi 1
  • Mehdi Ghabooli 2
  • Majid Rostami 2
  • Zahra Movahedi 2
چکیده [English]

Abstract
Background and Objective: Piriformospora indica is an endophytic fungus, which transfers several benefits to hosts including enhance plant growth and induce tolerance to abiotic stress as heavy metals stress. The aim of this study was to investigate the effect of P. indica on some morphophysiological parameters of radish (Raphanus sativus) under normal conditions and heavy metal stress.
 
Materials and Methods: This experiment was conducted as a factorial experiment in a completely randomized design with three replications in the greenhouse of Agricultural Faculty of Malayer University. The experimental factors included four heavy metals (zinc, nickel, lead and control) and three fungal inoculums (inoculated with spores and mycelium and non-inoculated). Shoot dry weight, relative water content, photosynthetic pigments, electrolyte leakage, total soluble carbohydrate, protein and proline contents were investigated parameters.
 
Results: The results showed that the heavy metal stress significantly decreased dry weight, RWC, chlorophyll, total soluble carbohydrate, protein and proline contents; whereas inoculation with fungual spore and mycelium affected parameters such as proline, total soluble carbohydrate and protein and mitigated the adverse effect of heavy metal stress. Heavy metal stress with increasing electrolyte leakage causes membrane instability, whereas inoculation with P. indica especially spore decreased lipid peroxidation.
 
Conclusion: Using biotic methods can play an important role in counteracting with toxic effect of heavy metals. Based on these results and because P. indica can be propagated axenically on various medium, it can be concluded that this endophytic fungus serves as a promising approach to clean soil contaminated with heavy metal ions.
 
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Phtotosynthetic pigmants
  • Lipid peroxidation
  • heavy metal stress
  • Symbiosis
  • Electrolyte leakage

مقدمه

امروزه به دلیل توزیع مواد زائد خانگی، صنعتی و کشاورزی توسط انسان، محیط زیست درحال آلوده شدن با مواد آلی و معدنی می‌باشد. اصلی‌ترین ترکیب آلاینده­های معدنی، فلزات سنگین از جمله مس، سرب، روی، آهن و کادمیم می‌باشد (دبیری 2000). در بین فلزات سنگین عناصری وجود دارد که بعنوان عناصر کم­مصرف (Fe, Mo, Mn, Zn, Ni,  و ...) برای متابولیسم گیاهی با اهمیت هستند اما وقتی مقدار آنها در محیط رشد گیاه زیادتر از حد نرمال باشد، برای گیاهان مسمومیت‌زا هستند. امکان اصلاح خاک‌های آلوده به فلزات سنگین با استفاده از تکنیک‌های شیمیایی، فیزیکی و یا زیستی وجود دارد، اما روش‌های فیزیکی و شیمیایی معمولا هزینه‌بر، وقت گیر و تخریب‌کننده محیط زیست می‌باشند. از این رو، طی سال‌های اخیر پژوهشگران درصدد طراحی و توسعه تکنیک‌های زیستی برآمدند که بتوانند مکان‌های آلوده به فلزات سنگین را بدون آنکه بر حاصلخیزی و تنوع بیولوژیکی خاک اثرات سوئی داشته باشند، پاکسازی و تعدیل نمایند (سروار و همکاران 2017).

گیاهان بطور وراثتی مکانیسم‌های مشخصی برای مبارزه با خسارت تنش اکسیداتیو و مقابله با اثرات مضر گونه­های فعال اکسیژن (ROSها) دارند که این مکانیسم‌ها شامل افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی (SOD، CAT، و POX) و غیر آنزیمی نظیر گلوتاتیون، تیول و کارتنوئیدها می‌باشد (تونواجام و همکاران 2014). از طرفی ارتباط همزیستی گیاهان با قارچ‌های میکوریزا نقش مهمی در سیستم دفاعی گیاه بازی کرده و می‌تواند به نحو موثری فلزات سنگین را در خاک محدود و اثرات آن را تخفیف دهد (لاتف و همکاران 2016). ژن‌های مختلف درگیر در مقاومت به فلزات سنگین از قبیل ترانسپورترهای ZIP، متالوتیونین‌ها و گلوتاتیون اس ترانسفراز در گیاهان کلونیزه‌شده با قارچ‌های میکوریزا افزایش بیان داشته‌اند (هیلدبرانت و همکاران 2007).

یکی از قارچ‌های اندوفیت شبه­میکوریزا، قارچ Piriformospora indica می‌باشد که در سال 1998 توسط وارما و همکاران (1999) در کشور هندوستان شناسایی گردید. این قارچ با تعداد زیادی از گیاهان عالی رابطه همزیستی برقرار نموده و توانایی معنی‌داری برای غیرفعال کردن فلزات سنگین در ریشه‌ها دارد که می تواند در زیست‌پالایی امیدوار کننده باشد (گیل و همکاران 2016). تاثیر قارچ P. indica بر مقاومت به تنش فلزات سنگین در گزارش‌های کمی مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج نشان داد تلقیح با قارچ P. indica از طریق افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و محتوای کلروفیل و همچنین کاهش ROS، باعث افزایش مقاومت به تنش فلز سنگین کادمیوم در گل آفتابگردان (شهابی نیا و همکاران 2013)، تنباکو (هوی و همکاران 2015)، برنج (دابرال و همکاران 2019) و یونجه (لی و همکاران 2020) می­شود. ناندا و آگراوال (2018) نشان دادند که افزایش پرولین و آنزیم­های آنتی­اکسیدانت در کنار کاهش پراکسیداسیون لیپید و پراکسید هیدروژن در گیاهان Cassia angustifolia تلقیح­شده با قارچ P. indica باعث مقاومت آنها به تنش فلز سنگین مس می­شود. سرتیپ­نیا و همکاران (2013) نتایج مشابهی در مورد گیاهان گوجه­فرنگی در شرایط تنش سرب گزارش کردند. همچنین گزارش شده است که تلقیج گیاه گندواش با قارچ مذکور باعث افزایش زیست­توده، آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و ترکیبات فنلی شده و مقاومت به تنش آرسنتیک را افزایش می­دهد (رحمان و همکاران 2019). نتایج این مطالعات نشان می­دهد که قارچ می­تواند به عنوان یک عامل بالقوه برای حذف زیستی فلزات سنگین مورد توجه قرار گیرد. از اینرو، کاربرد عملی P. indica در پاک‌سازی زمین‌های آلوده به فلزات سنگین نیاز به بررسی بیشتری دارد و می‌تواند ابزار مهمی در کشاورزی پایدار باشد.

تربچه (Raphanus sativus L.) گیاهی یکساله و علفی از خانواده شب‌بو و در مناطق مختلف ایران کشت می‌شود. بخش خوراکی این گیاه ستبر و در تماس مستقیم با خاک قرار دارد. بنابراین فلزات سنگین به راحتی در آن تجمع یافته و برای مصرف‌کنندگان مضر خواهند بود. این گیاه در بسیاری از نقاط دنیا به واسطه دوره رشد کوتاه و ارزش غذایی بالا کشت می‌شود (اکرم و همکاران 2015). با اینحال، مطالعات معدودی در زمینه تاثیر تنش‌های غیر زیستی مانند خشکی و فلزات سنگین بر روی این گیاه انجام شده است.

با توجه به اینکه گیاهان نقـش مهمی در انتقال فلزات سنگین در خاک‌های آلوده بر عهده دارند، در نتیجه می‌توانند سبب ورود سموم به چرخه غذایی گردند. از اینرو بررسی جذب فلزات توسط گیاهان به خصوص سبزیجات از اهمیـت ویژه‌ای برخوردار است. هدف مطالعه حاضر ارزیابی تاثیر ارتباط همزیستی قارچ اندوفیتP. indica  با گیاه تربچه بر مقاومت به فلزات سنگین روی، سرب و نیکل و توانایی قارچ در کاهش اثرات مضر این فلزات در گیاه مذکور می‌باشد.

 

مواد و روش‌ها

تهیه، تشخیص و تکثیر مایه تلقیح قارچ   P. indica

برای کشت قارچ از محیط کشت پیچیده (محیط کشت آسپرژیلوس تغییر یافته حاوی عناصر ماکرو، میکرو، عصاره مخمر، پپتون و کازئین) استفاده شد. کشت جدایه قارچ مطابق با روش قبولی و همکاران (2013) انجام و پس از جمع‌آوری اسپورهای قارچ، تعداد اسپورها با استفاده از لام نئوبار شمارش گردید. برای تهیه میسلیوم، دیسک‌های فعال قارچ از محیط کشت برداشته و در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 100 میلی‌لیتر محیط کشت مایع قرار داده و سپس در شیکر انکوباتور با دمای 2±28 درجه سانتی‌گراد و 150 دور در دقیقه به مدت 10-7 روز قرار داده شدند. در مرحله بعد با استفاده از فیلتر کاغذی، میسلیوم‌ها از محیط کشت جدا و سپس چندین بار با آب مقطر شستشو داده شد (بجاج و همکاران 2015).  

کشت گیاه و اعمال تیمارها

این آزمایش به ‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در شرایط کنترل­شده گلخانه انجام شد. تیمارهای آزمایش شامل مایه تلقیح مختلف قارچ (میسلیوم، اسپور و شاهد بدون قارچ) به‌عنوان فاکتور اول و سه نوع فلز سنگین (شامل نیترات سرب، نیترات روی، نیترات نیکل و شاهد) به عنوان فاکتور دوم می‌باشد. در تیمار با اسپور قارچ، بذرهای جوانه‌دار شده با سوسپانسیون اسپور قارچ (حاوی 105×5 اسپور در میلی لیتر) تلقیح و به مدت یک ساعت بر روی شیکر با 70 دور در دقیقه قرار داده شدند تا امکان اتصال اسپورهای قارچ به سطح ریشه‌چه فراهم شود، سپس گیاهچه‌های تلقیح‌شده در گلدان کاشته شدند. برای تیمار میسلیوم، از مخلوط 1% (وزنی به وزنی) میسیلیوم و خاک استفاده و سپس گیاهچه‌ها در آن کاشته شدند. گلدان‌ها پس از کشت به گلخانه منتقل و به مدت 2 ماه نگهداری گردیدند. برای اعمال تنش فلزات سنگین، ابتدا محلول حاوی فلزات سنگین (سرب، نیکل و روی) تهیه و سپس گلدان‌ها با محلول حاوی فلزات سنگین با غلظت 500 میلی­گرم در لیتر آبیاری شدند تا میزان مورد نظر از فلزات سنگین به خاک اضافه شود. سپس گلدان­ها به مدت دو ماه در شرایط طبیعی حفظ شدند. لازم به ذکر است که در شرایط کنترل (عدم اعمال تنش فلزات سنگین)، آبیاری گلدان‌ها با آب آبیاری و بدون فلزات سنگین انجام گرفت. چهار هفته پس از خروج گیاهچه­ها، نمونه‌برداری از اندام­های هوایی صورت گرفت و صفاتی مانند ارتفاع بوته، تعداد برگ در هر گیاه، وزن خشک اندام هوایی، محتوای نسبی آب، رنگیزه‌های فتوسنتزی، کربوهیدرات، پرولین و پروتئین مورد سنجش قرار گرفتند.

 

بررسی صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک

پس از تعیین وزن­تر نمونه‌های گیاهی برداشت‌شده، نمونه‌های مذکور به مدت 48 ساعت در آون با دمای 75 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و وزن خشک آن‌ها نیز محاسبه گردید. برای اندازه­گیری محتوای نسبی آب برگ (RWC)، از روش بار و وثرلی (1962) و معادله RWC (%)= [(FW - DW)/(TW - DW)] × 100 استفاده شد که در آن FW، TW و DW به ترتیب وزن تر، وزن آماس و وزن خشک می­باشد. رنگیزه‌های برگ (کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل) با استفاده از استون 80 درصد، استخراج و سنجش آن مطابق با روش آرنون (1949) انجام شد. غلظت کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئید به ترتیب در طول موج­های 663، 645، 652 و 470 نانومتر تعیین گردید. نشت یونی مطابق با روش والنتوویچ و همکاران (2006) و با استفاده از برگ­های تازه و دستگاه EC متر اندازه‌گیری شد. ابتدا هدایت الکتریکی اولیه (EC1) اندازه‌گیری و سپس نمونه‌ها در 120 درجه سانتی­گراد به مدت 20 دقیقه اتوکلاو و بعد از کاهش دما تا دمای محیط، هدایت الکتریکی مجدداً اندازه‌گیری شد (EC2). نشت یونی از طریق رابطه EL= (EC1/EC2)×100 محاسبه گردید. استخراج و اندازه‌گیری پروتئین کل به روش رنگ­سنجی برادفورد (1987) و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد. از سرم آلبومین گاوی به عنوان استاندارد استفاده شد. استخراج کربوهیدرات کل محلول از بافت تر به روش ایروجوین و همکاران (1992) با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 620 نانومتر قرائت و با استفاده از منحنی استاندارد بدست آمده از غلظت‌های مختلف گلوکز بیان گردید. جهت سنجش پرولین روش بیتس و همکاران (1973) انتخاب شد و نمونه­ها با استفاده از معرف نین­هیدرین و در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. استخراج فنول کل به وسیله معرف فولین سیوکالتیو مطابق با روش سینگلتون و روسی (1965) صورت گرفت و در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. مقدار فنول کل با استفاده از منحنی کالیبراسیون استانداردی که برای اسید گالیک در غلظت‌های مختلف تهیه شده بود، محاسبه شد. به‌منظور مقایسه گیاهان شاهد و گیاهان تلقیح شده با قارچ P. indica، تجزیه آماری نتایج، با استفاده از نرم‌افزار MSTAT-C:2015 انجام گردید. مقایسه میانگین‌ها نیز در سطح 5% و بر اساس آزمون دانکن انجام شد.

نتایج و بحث

وزن خشک اندام هوایی

بر اساس نتایج به‌دست ‌آمده اثرات ساده تنش فلزات سنگین بر وزن خشک اندام هوایی در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار شد اما اثر ساده قارچ و اثرات متقابل معنی‌دار نشد (جدول 1). تنش فلزات سنگین باعث کاهش وزن خشک گردیده است، به‌طوریکه کمترین وزن خشک مربوط به تیمار فلز سنگین سرب (0/4 گرم در بوته) و بیشترین میزان آن مربوط به شاهد (0/7 گرم در بوته) بود (شکل 1). اگرچه اثرات قارچ بر وزن خشک اندام هوایی گیاهان تلقیح­شده معنی‌دار نبود اما قارچ تا حدی توانسته بود اثرات مضر فلزات سنگین را بر وزن خشک گیاهان تلقیح­شده جبران نماید؛ بطوریکه گیاهان تلقیح‌شده نسبت به گیاهان شاهد سریعتر رشد کرده، ارتفاع بیشتری داشته و دارای تعداد بیشتری برگ بودند (داده‌های مرتبط با ارتفاع و تعداد برگ آورده نشده است اما نتایج نشان­ داد تلقیح با قارچ خصوصا میسیلیوم قارچ تعداد برگ و ارتفاع گیاه را افزایش می­دهد).

بیوماس (زیست توده) و رشد طولی گیاه به عنوان شاخص‌های سمیت فلزات سنگین در گیاهان شناخته می‌شوند. پژوهش‌های متعددی نشان داده است که وقتی گیاهان در معرض غلظت‌های بالای فلزات سنگین قرار می‌گیرند، وزن­تر و خشک گیاه و طول بخش هوایی و ریشه کاهش می‌یابد (امیدبیگی 2009). تاثیر نامطلوب فلزات  سنگین  بر  ارتفاع،  وزن   خشک و  تر  و   دیگر شاخص‌های رشدی برنج گزارش شده است که نتایج مطالعه حاضر با آن منطبق می‌باشد. از مهم‌ترین دلایل کاهش معنی‌دار عملکرد و ماده خشک گیاه در شرایط تنش می‌توان به کاهش تقسیم سلولی، بسته شدن روزنه‌ها، کاهش فتوسنتز و متعاقبا ممانعت از رشد اشاره کرد (شانکر و همکاران 2005).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-  نتایج مقایسه میانگین تیمارهای مختلف فلزات سنگین در وزن خشک اندام هوایی گیاه تربچه

 

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس محتوای نسبی آب و رنگیزه­های فتوسنتزی گیاه تربچه تحت تنش فلزات سنگین و قارچ

منابع تغییر

درجه آزادی

وزن خشک اندام هوایی

محتوای نسبی آب

کلروفیل  a

کلروفیل  b

کلروفیل  کل

کارتنوئید

نشت یونی

کربوهیدرات

پرولین

پروتئین

قارچ

2

ns083/2

ns 29/6

ns0398/0

ns0137/0

ns113/0

ns0006/0

**628/36

**0472/0

**881/1

**0043/0

فلزات سنگین

3

**24/16

ns44/3

ns0422/0

ns0112/0

*181/0

**0101/0

*018/15

**0320/0

**618/0

**0086/0

قارچ×فلزات سنگین

6

ns 30/1

*49/18

**0725/0

*0474/0

**268/0

*0057/0

*944/17

**0048/0

**028/0

**0006/0

خطای آزمایش

24

79/1

42/5

0173/0

0145/0

048/0

0019/0

859/4

0001/0

0005/0

000/0

ضریب تغییرات

-

54/6

24/2

17/2

34/1

89/.

07/1

61/3

55/0

15/0

44/0

ns  و ** و* به ترتیب غیر معنی‌داری و معنی‌داری در سطح 1 و 5 درصد  می باشد.

 

 

 

   تأثیر قارچ بر میزان وزن خشک گیاهان تلقیح‌شده با قارچ در شرایط تنش خشکی (قبولی و همکاران 2013)، شوری (والر و همکاران 2005) و فلزات سنگین (ناندا و آگراوال 2018) گزارش شده است. مکانیسم‌های مختلفی در ارتباط با تأثیر قارچ‌های اندوفیت بـر رشـد رویشی گیاهان ذکر شده است. در پژوهش حاضر، این تاثیرات معنی‌دار نبود که این امر می­تواند ناشی از دلایل متعددی از جمله کلنیزاسیون غیریکنواخت گیاهان یا پاسخ متفاوت گیاه به تلقیح با میسیلیوم یا اسپور قارچ باشد.

 

محتوای نسبی آب برگ

بر اساس نتایج به‌دست‌آمده برهمکنش تیمارهای مختلف قارچ و فلزات سنگین بر محتوای نسبی آب برگ در سطح احتمال 5 درصد معنی‌دار شد (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان­داد بیشترین محتوای نسبی آب برگ در گیاهان تلقیح‌نشده و تیمار شده با فلز سنگین نیکل (6/92 درصد) و کمترین اثر در تیمار شاهد تلقیح‌نشده (3/85 درصد) دیده ‌شده است (جدول 2).

محتوای آبی برگ‌ها به‌عنوان فاکتوری برای تعیین سطح آب گیاه شناخته‌ شده است که منعکس‌کننده فعالیت‌های متابولیکی در بافت‌هاست؛ کاهش محتوای نسبی آب برگ سبب کاهش فراهمی آب مورد نیاز برای فرایندهای مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی می‌گردد (فرخنده و همکاران 2012). کاظم­علیلو و صدقیانی (2012) در تحقیقی روی گیاه بنگدانه نشان دادند که در اثر سمیت با فلز سنگین سرب و با افزایش غلظت فلز، میزان نسبی محتوای آب برگ (RWC) کاهش یافت.

نتایج برخی بررسی‌ها نشان داده است که قارچ تاثیر مثبت و مستقیمی بر محتوای نسبی آب در شرایط تنش‌های غیر زیستی دارد (قبولی و همکاران 2011). به‌نظر می‌رسد میسلیوم‌های قارچ سطح جذب بالاتری را برای گیاهان میزبان فراهم آورده و از طرفی به نگهداری آب در اطراف آن کمک کرده‌اند و همین مسئله سبب شده است تا در شرایط یکسان، گیاهان تلقیح‌شده نسبت به گیاهان شاهد دارای محتوای نسبی آب بیشتری باشند.

 

رنگیزه های فتوسنتزی

بر اساس نتایج به‌دست‌آمده از تجزیه واریانس داده­ها، برهمکنش تیمارهای مختلف قارچ و فلزات سنگین بر میزان کلروفیل a و b معنی‌دار شد (جدول 1). معنی‌دار شدن اثرات متقابل نشان می‌دهد که دو فاکتور مستقل از هم عمل نکرده‌اند. بیشترین مقدار کلروفیل a در تیمار با میسلیوم و بدون تنش‌ فلزات سنگین (21/1 میلی‌گرم بر گرم وزن­تر) و کمترین اثر در تیمار با میسلیوم قارچ و فلز سنگین روی (69/0 میلی‌گرم بر گرم وزن­تر) دیده ‌شده است (جدول 2). بیشترین میزان کلروفیل b در تیمار اسپور و فلز سنگین روی (92/0 میلی‌گرم بر گرم وزن­تر) و کمترین اثر در تیمار قارچ میسلیوم و فلز سنگین روی  (55/0 میلی‌گرم برگرم وزن­تر) دیده‌ شده است (جدول 2).

     تجزیه واریانس داده­ها نشان­داد اثرات ساده تنش فلزات سنگین و اثرات متقابل تیمارهای قارچ و فلزات سنگین بر میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید معنی‌دار است (جدول 1). بیشترین میزان کلروفیل کل در تیمار با میسیلیوم و بدون تنش فلزات سنگین (55/2 میلی‌گرم بر گرم وزن­تر) و کمترین اثر در تیمار با میسلیوم و فلز سنگین روی (53/1میلی‌گرم برگرم وزن­تر) مشاهده شد. همچنین بیشترین میزان کاروتنوئید در تیمار با میسیلیوم و بدون تنش فلزات سنگین (44/0 میلی‌گرم بر گرم وزن­تر) و کمترین اثر در تیمار با میسلیوم و فلز سنگین روی (29/0 میلی‌گرم برگرم وزن­تر) دیده‌ شده است (جدول 2). 

فلزات سنگین به وسیله مهار آنزیم‌های گاما– آمینو لوالونیک اسید دهیدوژناز و پروتوکلروفیلد ردوکتاز سبب مهار بیوسنتز کلروفیل می‌شوند. بر همکنش متقابل فلز سنگین با گروه سولفیدریل آنزیم‌ها مهم‌ترین مکانسیم این مهارها عنوان شده است. علاوه بر مهار بیوسنتز کلروفیل به وسیلۀ فلزات سنگین، این فلزات باعث تجزیه زیستی کلروفیل نیز می‌شوند (شارما و دوبی 2005). کاروتنوئیدها کمتر تحت تاثیر فلزات سنگین قرار می‌گیرند و در نتیجه، موجب کمتر شدن نسبت کلروفیل به کاروتنوئید در گیاهان می‌شوند (واسیلو و یوردانو 1997).

نتایج به‌دست‌آمده نشان داد تلقیح قارچ باعث افزایش رنگیزه‌های فتوسنتزی نسبت به گیاهان شاهد می‌گردد که با نتایج کریمی و همکاران (2015) و باساک و همکاران (2011) مطابقت داشت. در پژوهشی دیگر مشخص شد تلقیح ریشه گیاه دارویی Coleus forskohlii با قارچ P. indica منجر به افزایش کلی زیست‌توده اندام

جدول 2- مقایسه میانگین صفات فیزیولوژیک گیاه تربچه تحت تأثیر تنش فلزات سنگین و تیمار با قارچ

پروتئین

 (mg.g-1FW)

پرولین

 (mg.g-1FW)

کربوهیدرات کل محلول (mg.g-1FW)

نشت یونی (%)

کارتنوئید

کلروفیل کل

کلروفیل b

کلروفیل a

محتوای نسبی آب (%)

تیمارها

f007/0

j331/0

f075/0

b04/4

ab375/0

abc10/2

ab753/0

ab972/0

b29/85

CF0

d051/0

i730/0

e115/0

a62/11

ab320/0

abc92/1

ab749/0

ab855/0

ab01/87

ZF0

e041/0

h903/0

e119/0

b11/4

b312/0

bc86/1

ab668/0

ab882/0

a57/92

NF0

e035/0

g050/1

e115/0

ab57/7

ab344/0

ab24/2

ab818/0

a083/1

ab62/90

PF0

f009/0

g073/1

ef106/0

b21/4

ab363/0

abc13/2

ab753/0

ab015/1

ab93/87

CF1

c071/0

d447/1

d205/0

b31/2

ab404/0

ab34/2

a913/0

a156/1

ab46/87

ZF1

c072/0

e340/1

cd233/0

b52/3

ab330/0

abc16/2

ab774/0

ab064/1

ab76/87

NF1

b087/0

b632/1

bc256/0

b32/3

b313/0

abc01/2

ab696/0

ab005/1

ab54/86

PF1

f009/0

f197/1

ef105/0

b71/2

a444/0

a55/2

ab894/0

a211/1

ab37/90

CF2

c078/0

c553/1

d201/0

b00/5

b288/0

c53/1

b548/0

b696/0

ab22/88

ZF2

b091/0

e377/1

b269/0

b41/5

ab331/0

abc03/2

ab780/0

ab060/1

ab48/86

NF2

a104/0

a835/1

a326/0

ab22/7

b313/0

bc77/1

ab644/0

ab958/0

ab48/87

PF2

میانگین­هایی که در یک ستون با حداقل یک حرف مشترک مشخص شده­اند، با یکدیگر اختلاف معنی­داری براساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال5 درصد ندارند.

(F0: تلقیح­نشده؛ F1: تلقیح شده با قارچ (اسپور)؛ F2: تلقیح شده با قارچ (میسیلیوم)؛  C: گیاه شاهد در شرایط بدون تنش فلزات سنگین؛ Z: تیمار با فلز روی؛ N: تیمار با فلز نیکل؛ P:تیمار با فلز سرب).

 

 

 

 

 

 

هوایی، محتوای کلروفیل a، b می‌گردد (داس و همکاران 2012). مطالعات مشابهی در رابطه با تاثیر قارچ بر میزان کلروفیل در گیاهان تلقیح‌شده در شرایط تنش‌های غیر زیستی نظیر فلزات سنگین (هوی و همکاران 2015) گزارش شده است. به نظر می‌رسد قارچ با تاثیر بر روی پروتئین‌های درگیر در فرآیند فتوسنتز و چرخه کالوین و افزایش بیان آن‌ها، نقش موثری در حفظ و پایداری فتوسنتز در گیاهان میزبان ایفا می‌کنند (کریمی و همکاران 2015).

 

 

 

نشت الکترولیت و پایداری غشاء

      بر اساس نتایج به دست­آمده از تجزیه واریانس داده­ها، اثر ساده قارچ در سطح 1 درصد و اثر ساده فلزات سنگین و اثرات متقابل تیمارها بر میزان نشت یونی در سطح 5 درصد معنی‌دار شد (جدول 1). معنی­دار شدن اثرات متقابل نشان می­دهد که دو فاکتور مستقل از هم عمل نکرده­اند. با بررسی جدول مقایسه میانگین (جدول 2)، مشاهده شد بالاترین میزان نشت یونی مربوط به تیمار فلز سنگین روی در گیاهان تلقیح‌نشده با قارچ (62/11درصد) بود. هم‌چنین نتایج نشان داد تیمار گیاهان تربچه با قارچ P. indica باعث کاهش نشت یونی در آن‌ها و افزایش پایداری غشاء می‌گردد؛ به‌طوری‌که تیمار با اسپور قارچ توانسته است اثرات منفی تنش فلز سنگین بر پایداری غشاء را تا حد زیادی خنثی نماید.

فلزات سنگین از طریق افزایش تجمع ROS و در اثر تنش اکسیداتیو حاصل از آن، منجر به آسیب به ساختار غشاء و ساختار آن می‌شوند؛ لذا قابلیت نفوذپذیری غشاهای آسیب‌دیده مختل می‌شود. همین امر باعث نشت الکترولیت‌ها به خارج سلول می‌شود (داوی و همکاران 2005). قارچ می‌تواند توسط جلوگیری از تشکیل ROS تحت شرایط تنش، بطور نسبی با این پاسخ تنش مقابله کند و مانع تجزیه این لیپیدها شود یا تجزیه آنها را به تاخیر اندازد (ناندا و آگراوال 2018). به‌نظر می‌رسد قارچ با کمک به پایداری غشاء و جلوگیری از نشت یونی در شرایط تنش به بهبود فعالیت‌های فیزیولوژیکی گیاه کمک شایانی می‌نماید. تاثیر قارچ­­های میکوریزا و همچنین قارچ­های شبه­میکوریزا مانند P. indica بر متابولیسم ROSها و کمک به حفظ هموستازی ROSها در شرایط تنش توسط پژوهشگران دیگر گزارش شده است (ناث و همکاران 2016).

 

محتوای کربوهیدرات، پرولین و پروتئین

       نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد اثرات ساده قارچ و تنش فلزات سنگین و اثرات متقابل تیمارها بر میزان کربوهیدرات، پرولین و پروتئین برگ گیاه تربچه در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار است (جدول 1). معنی­دار شدن اثرات متقابل در مورد این صفات نشان می­دهد که دو فاکتور مستقل از هم عمل نکرده­اند. نتایج مقایسه میانگین داده­ها نشان داد که کمترین میزان کربوهیدرات مربوط به تیمار بدون قارچ (075/0 میلی گرم بر گرم وزن­تر) در شرایط بدون تنش بود و بیشترین میزان کربوهیدرات مربوط تنش فلز سنگین سرب و تلقیح با میسلیوم قارچ (326/0 میلی گرم بر گرم وزن­تر) بود. همچنین نتایج مقایسه میانگین نشان داد که کمترین میزان پرولین مربوط به تیمار بدون قارچ (331/0 میکرومول بر گرم وزن­تر) در شرایط فاقد تنش بود و بیشترین میزان پرولین مربوط به تیمار با فلز سنگین سرب و میسلیوم قارچ (835/1 میکرومول بر گرم وزن­تر) بود. در کل نتایج نشان داد که کمترین میزان پروتئین مربوط به تیمار بدون قارچ (007/0 میلی گرم بر گرم وزن­تر) در شرایط طبیعی بود و بیشترین میزان پروتئین مربوط به تیمار با فلز سنگین سرب و میسلیوم قارچ (104/0 میلی گرم بر گرم وزن­تر) بود (جدول 2).

      درموارد متعددی سازش گیاهان به تنش‌های محیطی از جمله فلزات سنگین با انباشت متابولیت‌هایی مانند ترکیبات نیتروژن‌دار (پرولین، سایر آمینواسیدها و پلی‌آمین‌ها) و کربوهیدرات‌ها (ساکارز، سایر اولیگوساکاریدها و پلی‌ساکاریدها) انجام می‌گیرد (لاین و همکاران 2009). تجمع قندهای محلول و پرولین در شرایط تنش به تنظیم اسمولاریته سلول کمک می‌کند و موجب حفظ و نگهداری مولکول‌های زیستی و غشاها می‌گردد (ناندا و آگراوال 2018). در پژوهش حاضر نیز میزان کربوهیدرات‌ها تحت تنش فلزات سنگین افزایش پیدا کرد.

     تلقیح با قارچ سبب افزایش میزان کربوهیدرات در گیاهان تلقیح‌شده در شرایط مختلف رطوبتی شده است که با نتایج قبولی (2014) و باقری و همکاران (2013) مطابقت دارد. تلقیح با قارچ P. indica میزان کربوهیدرات‌های محلول و پرولین را افزایش داد (بالتراشات و همکاران 2008). تغییرات کربوهیدرات‌ها به دلیل ارتباط مستقیم آنها با فرایندهای فیزیولوژیکی نظیر فتوسنتز، انتقال و تنفس اهمیت خاصی دارند. به نظر می‌رسد قارچ با افزایش میزان کربوهیدرات‌ها در شرایط تنش به تثبیت فتوسنتز و فرایندهای متابولیسمی در این شرایط کمک شایانی می‌نماید. گزارش داده شده است که قارچ P. indica از طریق برخی انتقال­دهنده­های هگزوزی، جذب کربوهیدرات­ها را افزایش می­دهد. در رابطه همزیستی، کربوهیدرات بهایی است که گیاه در ازای فسفات عرضه شده توسط قارچ پرداخت می­کند (رانی و همکاران 2016).

      اسید آمینه پرولین فراوان ترین متابولیتی است که در بسیاری از گونه‌های گیاهی تحت تنش‌های غیر زیستی مانند فلزات سنگین تجمع می‌یابد (زابادوس و ساوور 2010). افزایش پرولین نوعی مکانیسم دفاعی است که باعث سازش بیشتر سلول با شرایط تنش و حفاظت از آنزیم‌هاى سیتوزول و ساختارهاى سلولى مى‌شود (وانگ و همکاران 2008). در پژوهش حاضر نیز گیاه تربچه به منظور دفاع در برابر تنش حاصل از فلز سنگین سرب، میزان پرولین آزاد را افزایش داد. به نظر می‌رسد افزایش میزان پرولین از طریق تجزیه پروتئین‌ها در برگ‌های بالغ  و یا سنتز پرولین در کلروپلاست‌ها باشد (کرس و هاره 1997).

      تاثیر قارچ بر محتوای پرولین گیاهان تلقیح‌شده توسط پژوهشگران مختلف گزارش شده است (قبولی 2014 و شهابیوند و همکاران 2017). گزارش شده است که قارچ P.indica از راه‎های مختلف نظیر افزایش سطوح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت‎ها، اسمولیت‎ها (به‌خصوص پرولین) و حفظ رنگیزه‎های کلروفیلی موجب افزایش تحمل به تنش در گیاه میزبان می‌گردد (زارع و همکاران 2012).

       گیاه با تجمع پرولین، افزایش ذخیره‌سازی کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌سازی می‌تواند در برابر تنش مقاومت کند (هونگ 2000). کاهش اولیه محتوای پروتئین می‌تواند به علت کاهش در سنتز بعضی پروتئین‌ها و یا احتمـالاً  افـزایش فعالیت آنزیم‌های پروتئولیتیک باشد (پاندا و خان 2003). مشاهده شده است که تحت شرایط تـنش، گونه‌های اکسیژن فعال (ROSها) می‌توانند با صدمه زدن به پروتئوم گیاه باعث نابودی شمار زیادی از پروتئین‌های گیاه شوند (تورگات و همکاران 2004). همچنین فلزات سنگین با اختلال در فرآیند تثبیت نیتروژن از طریق مهار فعالیت‌های آنزیم‌هایی ماننـد گلوتامین سینتاز، گلوتامات سینتاز و نیترات ردوکتاز و فرآیند احیاء نیترات سبب کاهش تولید پروتئین شده و رشد را متوقف می‌کنند (پاندا و خان 2003). بر اساس نتایج پژوهشگران، تیمارهای مختلف قارچ P. indica بر میزان پروتئین سنبل‌الطیب تاثیر معنی‌داری داشتند؛ بطوریکه هم در شرایط تنش و هم در شرایط نرمال، میزان پروتئین در گیاهان تلقیح‌شده به طور معنی‌داری بالاتر بود (لرستانی و همکاران 2018). باقری و همکاران (2013) نیز گزارش کردند که تیمار گیاهان برنج با قارچ P. indica باعث افزایش میزان پروتئین کل محلول می‌گردد.

 

نتیجه‌گیری کلی

        مطالعه حاضر با هدف ارزیابی اثرات سمیت القاء‌شده توسط فلزات سنگین روی، سرب و نیکل و به‌سازی این اثرات از طریق کلینزاسیون قارچ P. indica در گیاه تربچه انجام گردید. نتایج نشان داد که فلزات سنگین روی بسیاری از صفات اندازه گیری‌شده تاثیر منفی داشتند؛ از طرفی تلقیح گیاهان با اسپور و میسلیوم قارچ سبب بهبود برخی از صفات بررسی­شده گردیده است؛ بطوریکه افزایش معنی‌دار در سطح پرولین، کربوهیدرات و پروتئین در گیاهان تلقیح شده با قارچ
 P. indica مشاهده شد. علاوه بر بهبود پارامترهای حفاظتی، قارچ میزان نشت یونی ناشی از پراکسیداسیون لیپیدها را نیز پائین آورد. همچنین نتایج مقایسه اسپور و میسیلیوم قارچ نشان داد که هر دو مایه تلقیح (اینوکولوم) نتایج مثبتی بر صفات اندازه­گیری­شده دارند، بطوریکه میزان برخی صفات مانند رنگیزه­های فتوسنتزی در گیاهان تلقیح­شده با اسپور و برخی دیگر از صفات مانند کربوهیدرات کل محلول و پرولین در گیاهان تلقیح­شده با میسیلیوم قارچ بالاتر بود؛ اما با توجه به سهولت بیشتر تهیه میسیلیوم نسبت به اسپور، استفاده از آن در مطالعات آتی توصیه می­گردد. در مجموع نتایج بدست آمده با توجه به افزایش آلودگی خاک‌های زراعی و غیر زراعی به فلزات سنگین حائز اهمیت است و نشان می­دهد در آینده استفاده از اندوفیت­هایی نظیر P. indica می‌تواند نقش مهمی در مقابله با اثرات محدود‌کننده و مضر فلزات سنگین بازی کند؛ البته نیاز است که با پژوهش‌های بیشتر و بهینه‌سازی کلنیزاسیون ریشه، این امکان را عملی نمود.

 

سپاسگزاری

        بدینوسیله از حمایت­های مالی دانشگاه ملایر جهت انجام این پژوهش قدردانی می­گردد.

Akram NA, Noreen S, Noreen T and Ashraf M. 2015. Exogenous application of trehalose alters growth, physiology and nutrient composition in radish (Raphanus sativus L.) plants under water-deficit conditions. Brazilian Journal of Botany, 38: 431–439.
Arnon DI. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in beta vulgaris. Plant Physiology, 24: 1-15.
Bagheri A, Saadatmand S, Niknam V, Nejadsatari T and Babaeizad V. 2013. Effect of endophytic fungus, Piriformospora indica on growth and activity of antioxidant enzymes of rice (Oryza sativa L.) under salinity stress. International Journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 1(11): 1337-1350.
Bajaj R, Hu W, Huang Y, Chen S, Prasad R, Varma A and Bushley K.E. 2015. The beneficial root endophyte Piriformospora indica reduces egg density of the soybean cyst nematode. Biological Control, 90:193-199.
Baltruschat H, Fodor J, Harrach BD, Niemczyk E, Barna B and Gullner G. 2008. Salt tolerance of barley induced by the root endophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants. New Phytologist, 180: 501-510.
Barrs HD and Weatherley PE. 1962. A re-examination of the relative turgidity technique for estimating water deficits in leaves. Australian journal of Biological Sciences, 15 (3): 413-428.
Basak H, Demir K, Kasim R and Okay FY. 2011. The effect of endo-mycorrhiza (VAM) treatment on growth of tomato seedling grown under saline conditions. African Journal of Agriculture Research, 6(11): 2532-2538.
Bates LS, Walderd RP and Teare ID. 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39: 205-208.
Bradford MM. 1975. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry Quantities, 72: 248-254.
Dabiri M. 2000.  3rd edition. Environmental Pollution (water, soil and air). Etehad Publication. (In Persian).
Dabral S, Varma A, Choudhary DK, Bahuguna RN and Nath M. 2019. Biopriming with Piriformospora indica ameliorates cadmium stress in rice by lowering oxidative stress and cell death in root cells. Ecotoxicology and Environmental Safety, 186: 109741.
Das A, Kamal S, Shakil NA, Sherameti I, Oelmüller R, Dua M, Tuteja N, Johri AK and Varma A. 2012. The root endophyte fungus Piriformospora indica leads to early flowering, higher biomass and altered secondary metabolites of the medicinal plant, Coleus forskohlii. Plant Signaling and Behavior, 7(1): 103-112.
Davey MWE, Stals B, Panis J, Keulemans R and Swennen L. 2005. High Throughput determination of malondialdehyde in plant tissues. Analytical Biochemistry, 347: 201-207.
Farkhondeh R, Nabizadeh E and Jalilnezhad N. 2012. Effect of salinity stress on proline content, membrane stability and water relations in two sugarbeet cultivars. International Journal of Agriculture Research, 2(5): 385-392.
Ghabooli M, Shahriary F, Sepehrin M, Marashi H and Hosseini Salekdeh G. 2011. An evaluation of the impact of the endophyte fungus Piriformospora indica on some traits of barley (Hordeum vulgare L.) in drought stress. Agroecology, 3(3): 328-336. (In Persian).
Ghabooli M, Khatabi B, Ahmadi FS, Sepehri M, Mirzaei M, Amirkhani A and Salekdeh G.H. 2013. Proteomics study reveals the molecular mechanisms underlying water stress tolerance induced by Piriformospora indica in barley. Journal of Proteomics, 94: 289-301.
Ghabooli M. 2014. Effect of Piriformospora indica inoculation on some physiological traits of barley (Hordeum vulgare) under salt stress. Chemistry of Natural Compounds, 50(6): 1082-1087.
Ghabooli M, Lorestani S, Movahedi Z and Karimi R. 2018. An evaluation of fungus Piriformospora indica effects on some morphophysiological traits of valerine under drought stress. Journal of Iranian Plant Ecophysiological Research, 13(50): 41-52. (In Persian).
Gill SS, Gill R, Trivedi DK, Anjum NA, Sharma KK, Ansari MW, Ansari AA, Johri AK, Prasad R, Pereira E and Varma A. 2016. Piriformospora indica: potential and significance in plant stress tolerance. Frontiers in Microbiology, 7: 332.
Hare PD and Cress WA. 1997. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regulation, 21(2):79-102.
Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z and Verma DPS. 2000. Removal of feedback inhibition of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress. Plant Physiology, 122(4):1129-1136.
Hildebrandt U, Regvar M and Bothe H. 2007. Arbuscular mycorrhiza and heavy metal tolerance. Phytochemistry, 68: 139–146.
Hui F, Liu J, Gao Q and Lou B. 2015. Piriformospora indica confers cadmium tolerance in Nicotiana tabacum. Journal of Environmental Sciences, 37: 184-191.
Irigoyen JJ, Emerich DW and Sanchez-Diaz M. 1992. Alfalfa leaf senescence induced by drought stress: photosynthesis, hydrogen peroxide metabolism, lipid peroxidation and ethylene evaluation. Physiologia Plantarum, 84: 67-72.
Karimi F, Sepehri M, Afuni M and Hajabbasi M. 2015. Effect of Endophytic Fungus, Piriformospora Indica, on Barley Resistance to Lead. Isfahan University of Technology, 19 (71): 311-321 (in Persian).
Kazemalilo S and Rasolisadaghiani M. 2013. Effect of soil cadmium pollution on some physiological parameters of Hyoscyamus plant in presence/absence of growth-promoting microorganisms. Water and Soil Science, 22(4): 17-30. (In Persian)
Khalid M, Kayani SI and Tang K. 2020. The ameliorative effects of exogenous inoculation of Piriformospora indica on molecular, biochemical and physiological parameters of Artemisia annua L. under arsenic stress condition. Ecotoxicology and Environmental Safety, 206:111202.
Latef AAHA, Hashem A, Rasool S, AbdAllah EF, Alqarawi AA, Egamberdieva D, Jan S, Anjum NA and Ahmad P. 2016. Arbuscular mycorrhizal symbiosis and abiotic stress in plants: a review. Journal of plant Biology, 59: 407–426.
Li L, Zhu P, Wang X and Zhang Z. 2020. Phytoremediation effect of Medicago sativa colonized by Piriformospora indica in the phenanthrene and cadmium co-contaminated soil. BMC biotechnology, 20: 1-14.
Line CJ, Liu L, Liu T, Zhu L, Sheng D and Wang D. 2009. Soil amendment application frequency contributes to phytoextraction of lead by sunflower at different nutrient levels. Environmental and Experimental Botany, 65: 410-416.
Nanda R and Agrawal V. 2018. Piriformospora indica, an excellent system for heavy metal sequestration and amelioration of oxidative stress and DNA damage in Cassia angustifolia Vahl under copper stress. Ecotoxicology and Environmental Safety, 156: 409-419.
Nath M, Bhatt D, Prasad R, Gill SS, Anjum NA and Tuteja N. 2016. Reactive oxygen species generation-scavenging and signaling during plant-arbuscular mycorrhizal and Piriformospora indica interaction under stress condition. Frontiers in Plant Science, 7: 1-7.
Omidbeigi R. 2009. Production and processing of medicinal plants 5th edition. Publication of Astan Quds Razavi. (In Persian).
Panda S and Khan M. 2003. Antioxidant efficiency in rice (Oryza sativa L.) leaves under heavy metal toxicity. Journal of Plant Biology, 30 (1): 23-30.
Rani M, Raj S, Dayaman V, Kumar M, Dua M and Johri AK. 2016. Functional characterization of a hexose transporter from root endophyte Piriformospora indica. Frontiers in Microbiology, 7:1083.
Sartipnia N, Khavari-Nejad RA, Babaeizad V, Nejad-Sattari T and Najafi F. 2013. Effect of Piriformospora indica on antioxidant enzymes activity of tomato (Lycopersicon esculentum mill) under lead stress. International Journal of Biosciences, 3: 55–64.
Sarwar N, Imran M, Shaheen MR, Ishaque W, Asif Kamran MA, Matloob A, Rehim A and Hussain S. 2017. Phytoremediation strategies for soils contaminated with heavy metals: modifications and future perspectives. Chemosphere, 171: 710-721.
Shahabivand S, Parvaneh A and Aliloo AA. 2017. Root endophytic fungus Piriformospora indica affected growth, cadmium partitioning and chlorophyll fluorescence of sunflower under cadmium toxicity. Ecotoxicology and Environmental Safety, 145: 496-502.
Shanker AK, Cervantes C, Loza-Tavera H and Avudainayagam S. 2005. Chromium toxicity in plants. Environment international, 31(5): 739-753.
Sharma P and Dubey RS. 2005. Lead toxicity in plants. Brazilian Journal of Plant Physiology, 17: 35–52.
Singleton VL and Rossi A. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-posphotungustic acid reagent. American journal of Enology and Viticulture, 16(3): 144-158.
Szabados L and Savoure A. 2010. Proline: a multifunctional amino acid. Trends in Plant Science, 15(2): 89-97.
Thounaojam TC, Panda P, Choudhury S, Patra HK and Panda S. K. 2014. Zinc ameliorates copper-induced oxidative stress in developing rice (Oryza sativa L.) seedlings. Protoplasma, 251: 61–69.
Turgut C, Pepe MK and Cutright TJ. 2004. The effect of EDTA and citric acid on phytoremediation of Cd, Cr, and Ni from soil using Helianthus annuus. Environmental Pollution, 131 (1): 147-154.
Valentovic P, Luxova M, Kolarovic L and Gasparikova O. 2006. Effect of osmotic stress on compatible solutes content, membrane stability and water relations in two maize cultivars. Plant Soil and Environment, 52: 186-191.
Vassilev A and Yordanov I. 1997. Reductive analysis of factors limiting growth of cadmium –treated plants: A Review. Journal of Plant Physiology, 23(3-4): 114-133.
Waller W, Achatz B, Baltruschat H, Fodor J, Becker K, Fischer M, Heier T, Huckelhoven R, Neumann C, Wettstein D, Franken P and Kogel KH. 2005. The endophytic fungus Piriformospora indica reprograms barley to salt stress tolerance, disease resistance and higher yield. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102: 13386-13391.
Wang L, Zhou Q, Ding L and Sun Y. 2008. Effect of cadmium toxicity on nitrogen metabolism in leaves of Solanum nigrum L. Journal of Hazardous Materials, 154(1-3): 818-825.
Zarea MJ, Hajinia S, Karimi N, Mohammadi Goltapeh E, Rejali F and Varma A. 2012. Effect of Piriformospora indica and Azospirillum strains from saline or non-saline soil on mitigation of the effects of NaCl. Soil Biology and Biochemistry, 45: 139-146.