اثر ترکیب برخی پروبیوتیک‌ها در مهار بیماری زردی و پژمردگی فوزاریومی (ناشی از Fusarium redolens Wollenweber) و تحریک رشد نخود

مقدمه

حبوبات یکی از منابع مهم پروتئینی برای جمعیت رو به رشد بشر هستند. در میان حبوبات کشت‌شده در سراسر جهان، نخود (Cicer arietinum L.) به دلیل اهمیت غذایی و نقشی که در مدیریت حاصلخیزی خاک به‌ویژه در مناطق خشک دارد، دارای ارزش بالایی است (جیمِنز-فرناندز و همکاران 2011؛ رحمان و همکاران 2013). بیماری‌های خاکزاد مختلفی نخود را آلوده می‌کنند که از مهم‌ترین آن‌ها عوامل زردی و پژمردگی فوزاریومی هستند (رحمان و همکاران 2013). این عوامل باعث کاهش عملکرد و کیفیت محصول شده و در شرایط مطلوب برای اپیدمی شدن، قادرند  کل محصول را از بین ببرند (کالا و همکاران 2015). قارچ Fusarium redolens از عوامل ایجادکننده این بیماری است (اسماعیلی طاهری و همکاران 2011) که بیماری‌زایی آن روی نخود در سال‌های اخیر از ایران (زربانوی 2015) و کشورهای دیگر از جمله لبنان، مراکش، پاکستان و اسپانیا (جیمِنز-فرناندز و همکاران 2011) گزارش شده است. این بیمارگر سبب ایجاد نکروز در ریشه و طوقه و بروز زردی در بخش‌های هوایی نخود می‌شود که به سمت بخش‌های فوقانی گیاه توسعه می‌یابد (جیمِنز-فرناندز و همکاران 2011).

در کشاورزی پایدار، مدیریت تلفیقی آفات (IPM[1]) راهبردی اساسی برای حفاظت از گیاه در مقابل انواع بیماری‌های گیاهی است. در مورد پژمردگی‌های فوزاریومی، IPM مبتنی بر اصلاح روش‌های کشت، استفاده از ارقام مقاوم، استفاده حداقلی از مواد شیمیایی برای ممانعت از آلودگی و کنترل بیولوژیک با استفاده از میکروارگانیسم‌های پروبیوتیک می‌باشد (رحمان و همکاران 2013). از مهم‌ترین پروبیوتیک‌هایی که با ریشه گیاهان در تعامل‌اند ریزوباکتری‌های محرک رشد گیاه (PGPR[2]) هستند که علاوه بر کلنیزه نمودن ریشه گیاهان، موادی تولید می‌کنند که در افزایش رشد گیاه و حفاظت از آن در برابر بیماری‌های مختلف نقش دارند (سینگ و سینگ 2013). جنس‌های باکتریایی Alcaligenes و Delftia به دلیل تولید متابولیت‌های مختلف و بروز مکانیسم‌های متعدد به‌عنوان PGPR و کنترل‌کننده‌های کارآمد بیماری‌های گیاهی مختلف گزارش شده‌اند (ناندینی و همکاران 2014؛ مورل و همکاران 2015؛ پراساناکومار و همکاران 2015؛ بن‌عبداله و همکاران 2016). در میان قارچ‌های محرک رشد گیاه (PGPF[3])، اعضای جنس Trichoderma علاوه بر بهبود رشد گیاه، به دلیل دخالت در مکانیسم‌های کنترل زیستی مختلف نظیر رقابت، آنتی‌بیوزیس، مایکوپارازیتیسم و القای مقاومت در میزبان، از کارآمدترین آنتاگونیست‌های موفق برای مهار بیمارگرهای قارچی خاکزاد مختلف (کاستیلو و همکاران 2019) از جمله پژمردگی فوزاریومی نخود (F. oxysporum f.sp. ciceris) (دوبِی و همکاران 2007) هستند. میکوریزهای دارسانه‌ای (AMF[4]) نیز گروه مهمی از ارگانیسم‌های مفید ریزوسفر می‌باشند که با ریشه اکثر گیاهان همزیستی متقابل ایجاد نموده و با افزایش جذب آب و مواد غذایی و افزایش مقاومت گیاه به خشکی و عوامل بیماری‌زا (حاج‌احمد و همکاران 2019) در تغذیه و سلامت آن نقش دارند (آگنولوچی و همکاران 2015). قارچ میکوریزی Rhizophagus intraradices (با نام قبلی Glomus intraradices) از همزیست­های شناخته شده است که اثر آن در افزایش رشد گیاهان و کاهش شدّت بیماری‌های خاکزاد مختلف از جمله پوسیدگی فوزاریومی ریشه نخود (Fusarium solani f.sp. pisi) به اثبات رسیده است (سهرابی و همکاران 2015).

یکی از محدودیت‌های کاربرد عوامل کنترل زیستی، عملکرد ناپایدار و کارایی نامناسب آن‌ها در شرایط محیطی مختلف است که سبب می‌شود در رقابت با میکروفلور بومی و یافتن جایگاه مناسب برای بقا طی دوره‌های طولانی و فعال نمودن مکانیزم‌های مربوطه با مشکلات زیادی مواجه شوند (شِزِک 2008). همچنین احتمال دارد به دلیل تنوع ژنتیکی در جمعیت بیمارگر، یک سویه تأثیر یکسانی روی همه پاتوتیپ‌های موجود در جمعیت بیمارگر نداشته باشد (آلابووت و همکاران 2001). از راهبردهای غلبه بر این مشکل، استفاده از ترکیب دو یا چند عامل زیستی مختلف می‌باشد که ممکن است بتوانند با فراهم کردن چند مکانیسم مختلف مهار بیماری، داشتن الگوهای مختلف برای کلنیزاسیون گیاه، دارا بودن چند ویژگی جهت تحریک رشد، دسترسی بهتر گیاه به عناصر مورد نیاز، داشتن جامعه ریزوسفری باثبات‌تر و اثربخشی در طیف وسیع‌تری از شرایط محیطی، سلامت و عملکرد محصول و پایداری و کارایی کنترل زیستی بیماری را بهبود بخشند (آلابووت و همکاران 2001؛ سریواستاوا و همکاران 2010؛ پالمیری و همکاران 2016؛ آتوا 2018).

در مورد تعاملات هم‌افزا میان ترکیب عوامل زیستی و تأثیر مثبت آن‌ها در بهبود رشد گیاه یا حفاظت علیه بیماری‌های گیاهی خاکزاد، مستندات متعددی موجود است. در یک پژوهش، تلقیح ترکیبی Bacillus megaterium، Rhizobium و Trichoderma spp. جذب مواد غذایی، جوانه‌زنی، زیست‌توده کل و عملکرد نخود را در مقایسه با تلقیح منفرد این سویه‌ها یا شاهد تلقیح نشده افزایش داد (رودرِش و همکاران 2005). در آزمایش دیگری تیمار بذرهای خیار با ترکیب سه سویه PGPR مختلف شامل Bacillus subtilis، B. pumilusو Curtobacterium flaccumfaciens نسبت به کاربرد جداگانه آن‌ها، حفاظت بیشتر و کنترل پایدارتری در برابر چند بیمارگر خیار (Colletotrichum orbiculare، Pseudomonas syringae pv. lachrymans و Erwinia tracheiphila) ایجاد کرد (راوپاچ و کلوپر 1998). ترکیب R. intraradices با B. subtilis یا Trichoderma harzianum، به ترتیب پوسیدگی پیتیومی و فوزاریومی ساقه و ریشه کرفس (نِمِک و همکاران 1996) و پوسیدگی طوقه و ریشه فوزاریومی بوته‌های گوجه‌فرنگی (داتنوف و همکاران، 1995) را مؤثرتر از کاربرد جداگانه این سویه‌ها کنترل نمود. تحت شرایط گلخانه نیز ترکیب B. subtilis + AMF یا P. fluorescence + AMF نسبت به کاربرد منفرد این عوامل در افزایش شاخص‌های رشدی و عملکرد و مهار بیماری پوسیدگی ساقه لوبیا (Sclerotium rolfsii) کارآمدتر بود (محمد و همکاران 2019). در آزمایشی مزرعه‌ای بین ترکیب‌های مختلف Trichoderma، AMF و P. fluorescens، تیمار ترکیبی سه‌گانه این عوامل، بیشترین افزایش عملکرد و القای آنزیم‌های دفاعی در فلفل را نشان داد (دوک و همکاران 2017). البته گزارش‌هایی نیز در مورد عدم تأثیر ترکیب عوامل زیستی بر مهار بیماری یا افزایش رشد گیاه موجود است (تچامنی و همکاران 2011). در برخی موارد نیز ترکیب عوامل زیستی مختلف، اثر ضعیف‌تری نسبت به تیمارهای منفرد نشان داده‌اند (لارکین و فراول 1998؛ کاستیلو و همکاران 2019). بنابراین قبل از کاربرد ترکیب عوامل باکتریایی و قارچی ، باید از سازگاری آن‌ها با یکدیگر و عدم تأثیر آنتاگونیستی‌شان علیه هم اطمینان حاصل نمود (مارتینز-مدینا و همکاران 2009).

پژوهش‌های پیشین نویسندگان نشان داده‌اند که دو سویه باکتریایی Alcaligenes faecalis و Delftia tsuruhatensis توانایی خوبی در کنترل زیستی زردی و پژمردگی فوزاریومی ناشی از F. redolens داشته و سبب تحریک رشد نخود در حضور این بیمارگر می‌گردند (اطلاعات منتشر نشده). قابلیت کنترل زیستی برخی عوامل بیماریزای فوزاریومی نخود توسط R. intraradices و برخی گونه‌های تریکودرما نیز قبلاً به اثبات رسیده است (سینگ و همکاران 2013؛ سهرابی و همکاران 2015). در سال‌های اخیر F. redolens در مناطق غربی کشور به عنوان غالب‌ترین گونه عامل پژمردگی فوزاریومی نخود شناسایی شده است (زربانوی 2015). بر اساس نکات مذکور و اهمیت این بیمارگر در کاهش کیفیت و کمیت محصول نخود، و با توجه به اینکه تاکنون تحقیقی در زمینه استفاده ترکیبی از عوامل پروبیوتیک برای کنترل این بیمارگر در نخود ثبت نشده است، این پژوهش با چند هدف مشخص انجام شد که عبارتند از مقایسه قابلیت کنترل زیستی کاربرد جداگانه و ترکیبی قارچ Trichoderma asperellum RUT1، باکتری‌های A. faecalis 1624 و D. tsuruhatensis PIIR و میکوریز R. intraradices علیه F. redolens، ارزیابی توانایی این عوامل به‌صورت جدا و ترکیب با هم در تحریک رشد نخود در حضور بیمارگر مذکور، بررسی سازگاری ترکیب‌های مختلف این عوامل و تأثیر هم‌افزایی آن‌ها در مهار زیستی بیمارگر و تحریک رشد نخود انجام شد.

مواد و روش‌ها

تهیه جدایه بیمارگر Fusarium redolens و سویه‌های کنترل بیولوژیک

سویه‌ای از قارچ تریکودرما با نام Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg 1999 RUT1 (با نام اختصاری Ta) و سویه باکتریایی Delftia tsuruhatensis Shigematsu et al., 2003 PIIR (Dt) از مجموعه آنتاگونیست‌های بخش گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی و سویه باکتریایی Alcaligenes faecalis (Castellani and Chalmers 1919) Austin et al. 1981 (Af) از مرکز میکروارگانیسم‌های صنعتی ایران تهیه شدند. قارچ میکوریز Rhizophagus intraradices (N.C. Schenck & G.S. Sm.) C. Walker & A. Schüßler 2010 (Ri) نیز به صورت فرمولاسیون تجاری از شرکت زیست فناور توران (شاهرود) دریافت گردید. جدایه‌ای از قارچ بیماری‌زای Fusarium redolans (Fr) که شناسایی آن پیش‌تر بر اساس خصوصیات ریخت­شناختی و مولکولی انجام شده و بیماری‌زایی آن روی نخود به اثبات رسیده بود، از کلکسیون قارچ‌های بخش گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی تهیه شد.

آماده‌سازی مایه تلقیح بیمارگر و آنتاگونیست‌های باکتریایی و قارچی

برای تهیه مایه تلقیح باکتری‌های آنتاگونیست، یک لوپ از کشت ۲۴ ساعته باکتری‌های رشد یافته روی محیط آگار غذایی (NA[5])، به فلاسک‌های حاوی محیط مایع NB[6] انتقال یافت. فلاسک‌های حاوی کشت باکتری روی دستگاه شیکر با سرعت 1۵0 دور در دقیقه قرار گرفتند. پس از 48 ساعت با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج 600 نانومتر، تنظیم غلظت باکتریایی صورت گرفت. مایه تلقیح قارچ بیماریزای F. redolens و قارچ آنتاگونیست T. asperelleum نیز با افزودن ۱۰ قرص آگار یک سانتی‌متری از کشت جوان این قارچ‌ها روی محیط سیب‌زمینی دکستروز آگار، به فلاسک‌های حاوی ترکیب دو بار سترون محتوی ورمیکولیت، سبوس گندم و عصاره سیب‌زمینی دکستروز (به نسبت ۲:۱:۲) تهیه شد. فلاسک‌ها پس از مایه‌زنی، به مدت ۱۴ روز در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد نگهداری گردیدند.

ارزیابی اثر جداگانه و ترکیبی عوامل پروبیوتیک در مهار بیماری ناشی از Fusarium redolens و شاخص‌های رشدی نخود در شرایط گلخانه

به منظور مقایسه قابلیت کنترل زیستی کاربرد جداگانه و ترکیبی عوامل باکتریایی و قارچی  در بازدارندگی از F. redolens و تأثیر آن‌ها بر شاخص‌های رشدی نخود و امکان تأثیر هم‌افزایی ترکیب آن‌ها، آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار و ۱۷ تیمار در گلخانه با کشت گیاهان در گلدان اجرا شد. نام تیمارها در جدول ۱ قید گردیده است. ضدعفونی سطحی بذور نخود رقم سارالبا استفاده از اتانول ۷۰ درصد و هیپوکلریت سدیم نیم درصد انجام شده و پس از چند بار شستشو با آب مقطر، به مدت دو روز در ظروف پتری استریل شده حاوی لایه نازکی از آب مقطر قرار گرفتند. بستر رشد پایه گیاه شامل ترکیبی از پرلیت و پیت‌ماس ضدعفونی­شده (با نسبت ۲ به ۱)، به گلدان‌های پلاستیکی با قطر دهانه ۱۲ سانتی‌متر و حجم یک لیتر اضافه شد. مایه تلقیح جدایه‌های کنترل زیستی در زمان کاشت بذور به نسبت‌های ذکر شده به بستر کشت افزوده شدند؛ به ازای هر گلدان، مایه تلقیح میکوریز به میزان ۵۰ گرم (هر گرم خاک حاوی میکوریز دارای ۱۰۰ عدد اسپور قارچ) و T. asperelleum به نسبت ۱ به ۱۵ (حجمی) با بستر کشت مخلوط شد. در هر گلدان چهار عدد بذر نخود کاشته شد و پس از اطمینان از سبز شدن، یک گیاهچه حذف گردید. در تیمارهای دارای باکتری، بذرها قبل از کشت به مدت یک ساعت در سوسپانسیون حاوی 10^۸ سلول باکتری در میلی‌لیتر غوطه‌ور شدند و پس از کشت بذور، سوسپانسیون باکتری‌ها نیز به‌صورت تیمار اولین آبیاری به میزان ۱۰۰ میلی‌لیتر به هر گلدان افزوده شد. در تیمار شاهد از بستر کشت پایه بدون عوامل کنترل زیستی استفاده شد. دو هفته پس از کشت بذرها، مایه‌زنی بیمارگر با قرار دادن مایه تلقیح در حفره مرکزی گلدان به میزان یک پانزدهم حجم خاک گلدان و به روش جاسم و همکاران (2018) انجام شد. گلدان‌های تیمارهای مختلف در گلخانه به صورت تصادفی قرار گرفتند و تا زمان ظهور نشانه‌های بیماری، با شرایط دمایی ۵±۲۵ درجه سانتی‌گراد و ۱۶ ساعت نور نگهداری شدند و یک روز در میان با جریان بسیار ملایم آب حاوی ۱۰۰ پی‌پی‌ام کود کامل (NPK+TE, 20-20-20[7] ) آبیاری گردیدند.

تقریباً ۱۰ هفته پس از مایه‌زنی بیمارگر، بوته‌های نخود از گلدان بیرون آورده شده و ریشه‌ها با جریان ملایم آب کاملاً شسته شدند. سپس فاکتورهای رشدی نخود شامل طول، حجم، وزن تر و وزن خشک ریشه و نیز وزن تر و وزن خشک اندام‌هوایی در آن‌ها اندازه‌گیری شد. به منظور ارزش‌گذاری شدّت بیماری، دو شاخص زردی بوته و نکروز ریشه به‌صورت جداگانه و به ترتیب مطابق روش هوانگ و همکاران (1994) و اسماعیلی طاهری و همکاران (2011) با کمی تغییر و به‌صورت زیر محاسبه گردیدند: ۰: فاقد زردی در قسمت‌های هوایی یا نکروز ریشه، ۱: تا ۲۵ درصد زردی در قسمت‌های هوایی یا نکروز ۲۵ درصد ریشه، ۲: بین ۲۵ تا ۵۰ درصد زردی قسمت‌های هوایی یا نکروز ۲۵ تا ۵۰ درصد ریشه، ۳: بین ۵۰ تا ۷۵ درصد زردی قسمت‌های هوایی یا نکروز ۵۰ تا ۷۵ درصد ریشه، ۴: بین ۷۵ تا ۱۰۰ درصد زردی قسمت‌های هوایی یا نکروز ۷۵ تا ۱۰۰ درصد ریشه. اطلاعات حاصل از آزمایش توسط نرم‌افزار SAS (نسخه 9.3) و در قالب طرح کاملاً تصادفی تجزیه‌وتحلیل شدند. برای مقایسه میانگین‌ها از آزمون چنددامنه‌ای دانکن استفاده گردید و در کلیه محاسبات این تحقیق، سطح احتمال آماری پنج درصد در نظر گرفته شد.

ارزیابی درصد کلنیزه­شدن ریشه توسط R. intraradices در حضور و در فقدان بیمارگر

برای تعیین میزان قابلیت کلنیزه­شدن ریشه‌های نخود توسط میکوریز R. intraradices و اثر بیمارگر بر میزان میکوریزی شدن در ریشه، بذرهای نخود در دو سری گلدان چهارتایی حاوی بستر کشت پایه به همراه میکوریز کشت شدند و پس از دو هفته، به یک سری از گلدان‌ها بیمارگر افزوده شد. ۱۲ هفته پس از کاشت، ارزیابی میزان کلنیزاسیون ریشه‌ها توسط میکوریز به روش فیلیپس و هیمن (1970) با اندکی تغییر صورت گرفت. از ریشه‌های جوان هر گلدان یک گرم جدا شد و پس از شستشوی کامل با آب مقطر، به‌صورت قطعات یک سانتیمتری خرد گردیده و به لوله‌های حاوی هیدروکسید پتاسیم ۱۰ درصد منتقل شد. ریشه‌ها جهت رنگ‌بری، یک ساعت در حمام آب گرم با دمای ۹۰ درجه سلسیوس قرار گرفتند و پس از چند مرتبه شستشوی کامل با آب، ۵ دقیقه در محلول اسیدکلریدریک یک درصد قرار داده شدند. سپس بدون آنکه شست‌وشو داده شوند، به مدت یک ساعت در محلول لاکتوگلیسرول اسید فوشین 01 / 0 درصد و یک ساعت نیز در حمام آب گرم ۹۰ درجه سلسیوس قرار گرفته و پس از آن به مدت ۳۰ دقیقه در محلول لاکتوگلیسرول نگهداری گردیدند. 100 قطعه از ریشه‌های رنگ‌آمیزی شده مربوط به هر تیمار (تیمار میکوریز تنها و تیمار میکوریز+بیمارگر) با میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی ۱۰۰ و ۴۰ از نظر وجود اندام‌های مربوط به R. intraradices بررسی گردیدند. پس از شمارش ریشه‌های آلوده و غیر آلوده به میکوریز، درصد کلنیزاسیون ریشه مطابق روش سهرابی و همکاران (2015) تعیین شد.

نتایج

کلیه تیمارهای این آزمایش به‌استثنای تیمار Af+Ri+Ta، در سطح احتمال پنج درصد سبب کاهش معنی‌دار علائم نکروز ریشه ناشی از F. redolens شدند (شکل ۱- A). تیمارهای Af و Af+Ri با وجود این که با برخی تیمارهای دیگر در یک سطح آماری قرار گرفتند، اما با ۵۰ درصد کاهش شدّت نکروز ریشه نسبت به شاهد آلوده، بهترین اثر را در کاهش علائم نکروز داشتند. همچنین کلیه تیمارها به‌جز Af+Ri+Ta و Af+Dt+Ri و Af+Dt+Ri+Ta، علائم زردی اندام‌های هوایی را کاهش دادند. تیمارهای Dt و Af نیز به ترتیب با کاهش علائم زردی به میزان ۴۸ و ۴۱ درصد نسبت به شاهد آلوده، بهتر از سایر تیمارها بودند، هرچند که تفاوتشان با برخی تیمارهای دیگر معنی‌دار نبود (شکل ۱-B).

شکل 1 - اثر جداگانه و ترکیبی سویه‌های باکتریایی و قارچی  بر شدّت زردی (A) و نکروز ریشه (B) ناشی از قارچ F. redolens در گلخانه

Fr =Fusarium redolens infected control, Af = Alcaligenes faecalis 1624, Dt = Delftia tsuruhatensis PIIR, Ri= Rhizophagus intraradices, Ta = Trichoderma asperelleum RUT1 and HC = healthy control.

جدول 1 - اثر سویه‌های باکتریایی و قارچی  بر پارامترهای رشدی نخود در حضور بیمارگر Fusarium redolens در گلخانه

اعداد درج‌شده در جدول، میانگین چهار تکرار هستند. حروف غیرمشترک قرار گرفته در کنار اعداد هر ستون، نمایانگر تفاوت آماری معنی‌دار تیمارها بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد می‌باشند.

Fr =Fusarium redolens is the infected control, Af = Alcaligenes faecalis, Dt = Delftia tsuruhatensis, Ri= Rhizophagus intraradices, Ta = Trichoderma asperelleum and HC = healthy control.

بررسی فاکتورهای رشدی نخود در حضور بیمارگر نشان داد به‌جز پنج تیمار (Af+Ri+Ta، Ri+Ta، Af+Dt+Ri، Dt+Ri و Af+Dt+Ri+Ta )، سایر تیمارها نسبت به شاهد آلوده سبب افزایش طول ریشه شدند. در صفت حجم ریشه نیز، تیمارهای Af+Ta، Ri+Ta و Af+Dt+Ri+Ta با شاهد آلوده در یک سطح آماری قرار گرفتند و تیمارهای Af+Ri+Ta، Af+Dt+Ri و Dt+Ri+Ta از شاهد آلوده نیز ضعیف­تر عمل کردند. سایر تیمارها (۹ تیمار) سبب افزایش حجم ریشه شدند. از این میان، تیمارهای Af و Dt به ترتیب با افزایش حجم ریشه به میزان ۵۶ و ۵۵ درصد نسبت به شاهد آلوده و ۱۱ و ۹ درصد نسبت به شاهد سالم بهترین اثر را داشتند. علاوه براین Af، Dt، Ta و ترکیب Af+Dt، Af+Ri و Af+Dt+Ta نسبت به شاهد آلوده، سبب افزایش وزن تر ریشه شدند که Af و Dt با افزایش این فاکتور به ترتیب به میزان ۴۲ و ۳۸ درصد نسبت به شاهد آلوده، بهترین تیمارها بوده و با شاهد سالم نیز در یک گروه آماری قرار گرفتند. اثر سایر تیمارها بر این فاکتور، خنثی (Af+Dt+Ri+Ta، Af+Ta، Dt+Ri، Dt+Ta و Ri) یا منفی (Dt+Ri+Ta، Af+Ri+Ta، Af+Dt+Ri و Ri+Ta) بود. همچنین کلیه تیمارها به ‌استثنای Af+Ri+Ta، Af+Dt+Ri و Af+Dt+Ri+Ta، نسبت به شاهد آلوده سبب افزایش وزن تر اندام‌هوایی شدند که برخی از آن‌ها (Af+Dt+Ta، Af+ Ta، Ta و Dt) نسبت به شاهد سالم نیز حداقل ۱۴ درصد این پارامتر را ارتقا دادند.

در کلیه تیمارهای این پژوهش به‌جز تیمارهای Af+Dt+Ri، Dt+Ri+Ta، Af+Ri+Ta و Af+Dt+Ri+Ta افزایش وزن خشک ریشه نسبت به شاهد آلوده مشاهده گردید. تیمارهای Af، Dt و ترکیب این دو (Af+Dt) با افزایش به ترتیب ۶۵، ۶۰ و ۶۰ درصدی این شاخص نسبت به شاهد آلوده، بهترین تیمارها بودند و با شاهد سالم نیز در یک گروه آماری واقع شدند. وزن خشک اندام‌هوایی در کلیه تیمارها به‌جز Af+Dt+Ri، Dt+Ri+Ta، Af+Ri+Ta، Af+Dt+Ri+Ta، Ri+Ta و Dt+Ri افزایش یافت و Af و Dt با افزایش این پارامتر به میزان 35 و ۳۱ درصد نسبت به شاهد آلوده و ۱۶ و ۶۸/۸ درصد نسبت به شاهد سالم، بهتر از دیگر تیمارها بودند.

ارزیابی کلنیزاسیون ریشه توسط R. intraradices

بررسی‌های میکروسکوپی مشخص نمود در تیمار میکوریز ۷۴ درصد و در تیمار میکوریز و بیمارگر ۴۵ درصد از قطعات ریشه نخود توسط R. intraradices کلنیزه شده‌اند. بنابراین F. redolens کلنیزاسیون ریشه توسط R. intraradices را 18/39 درصد کاهش داد.

بحث

در این پژوهش، اثر کاربرد جداگانه و ترکیبی چند سویه مختلف باکتریایی و قارچی  در مهار بیماری زردی و پژمردگی فوزاریومی نخود (F. redolens) و پارامترهای رشدی آن در گلخانه و در حضور این بیمارگر بررسی شد. در این تحقیق، کاربرد هر چهار عامل پروبیوتیک به صورت جداگانه سبب کاهش بروز علائم بیماری و افزایش رشد گیاه گردید. به‌ویژه Af و Dt که در میان کلیه تیمارها، بهترین اثرها را در افزایش رشد و کاهش بیماری داشتند. این دو سویه باکتریایی اثر کنترل زیستی قابل‌توجهی نیز علیه پژمردگی فوزاریومی گوجه‌فرنگی (F. oxysporum f.sp. lycopersici) و افزایش شاخص‌های رشدی گوجه‌فرنگی در حضور این بیمارگر نشان داده‌اند و قابلیت تولید اکسین و علاوه بر آن توانایی حل نمودن فسفات‌های معدنی و تولید سیدروفور را داشته‌اند (سیفی 2019). تولید ترکیبات اکسینی توسط برخی PGPR می‌تواند منجر به تغییر ساختار ریشه، افزایش مقدار زیست‌توده و تولید ریشه‌های جانبی در گیاهان و متعاقباً بهبود جذب مواد غذایی و افزایش کلی رشد آن‌ها شود (سینگ و سینگ 2013؛ افضل و همکاران 2019). در پژوهش حاضر نیز این دو سویه قادر بودند در حضور بیمارگر، حجم ریشه را به صورت معنی­داری افزایش دهند. فسفر نیز یکی از عناصر ضروری مورد نیاز گیاهان جهت رشد و انجام فرآیندهای بیولوژیکی مختلف می‌باشد که معمولاً با اجزای خاک به‌صورت ترکیبات کم محلول تا نامحلول در می‌آید و دسترسی گیاه به آن دشوار است (سینگ و دوبِی 2018). البته افزایش در دسترس بودن فسفر توسط باکتری­های خاک می­تواند روی کلنیزاسیون ریشه توسط میکوریزها اثر منفی داشته باشد (لاگوس و همکاران، 2018). در این پژوهش، ترکیب دو سویه باکتریایی با یکدیگر (Af+Dt) نیز سازگاری داشت و از بهترین تیمارهای افزاینده شاخص‌های رشدی نخود بود که سبب کاهش علائم بیماری نیز گردید. اما نسبت به کاربرد جداگانه این باکتری‌ها اثر هم‌افزایی بر شاخص‌های ارزیابی‌شده نداشت. برخی مطالعات قبلی نیز نشان داده‌اند که ترکیب سویه‌های PGPR نسبت به کاربرد جداگانه آن‌ها، نه‌تنها مزیتی جهت افزایش رشد و عملکرد گیاه (چیارینی و همکاران 1998؛ شاهین و همکاران 2004) یا بهبود اثر کنترل زیستی (لاتا و همکاران 2009) نداشته، بلکه در برخی موارد نسبت به مایه‌زنی جداگانه آن‌ها سبب عملکرد کمتر گیاه شده است. این موضوع ممکن است به دلیل رقابت این عوامل بر سر منابع انرژی در خاک یا تعاملات بین‌گونه‌ای میان آن‌ها باشد (چیارینی و همکاران 1998؛ اِلکوکا و همکاران 2010). در مقابل، در برخی مطالعات، تلقیح چندگانه باکتری‌ها در مقایسه با کاربرد جداگانه آن‌ها سبب کنترل کارآمدتر (پالمیری و همکاران 2016) و رشد یا عملکرد بهتر گیاه (ناندینی و همکاران 2014) شده است.

در این تحقیق، سویه T. asperellum به‌صورت منفرد، ترکیب با هر یک از دو سویه باکتریایی (Af+Ta و Dt+Ta) و یا ترکیب هم‌زمان با هر دو باکتری (Af+Dt+Ta) نقش مؤثری در کاهش بیماری و بهبود صفات رشدی نخود داشت. یاداو و همکاران (2013) نیز به اثر مثبت بیوپرایمینگ بذور نخود و لوبیا به‌صورت جدا و ترکیبی توسط T. asperellum، P. fluorescens و Rhizobium sp. بر رشد گیاه پی بردند اما برخلاف نتایج تحقیق حاضر، ترکیب عوامل مذکور نسبت به کاربرد تنهای آن‌ها اثر هم‌افزایی در بهبود رشد داشت. راجسواری و کاپور (2017) علت بهبود کنترل زیستی پژمردگی فوزاریومی بادام‌زمینی را در ترکیب T. viride و P. fluorescens نسبت به کاربرد جداگانه آن‌ها، وجود مکانیسم‌های متنوع کنترل زیستی و برهم‌کنش‌های خاص عوامل کنترل زیستی در ترکیب ذکر نمودند.

نتایج تحقیق حاضر با گزارش‌های مبنی بر اثر R. intraradices در کاهش بیماری‌های خاکزاد نخود نظیر پوسیدگی ریشه ناشی از F. solani f.sp. pisi (سهرابی و همکاران 2015) و Macrophomina phaseolina و کارایی این میکوریز در افزایش رشد گیاه (اختر و صدیقی 2007) سازگار هستند. افزایش جریان مواد غذایی در گیاهان میکوریزدار علاوه بر اینکه سبب بهبود رشد گیاه می‌شود، بلکه همراه با ایجاد تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سبب افزایش مقاومت مکانیکی گیاه و کاهش آسیب­پذیری آن در برابر حمله بیمارگر می‌گردد. همچنین گزارش شده است که رقابت با بیمارگرهای خاکزاد بر سر کلنیزاسیون مواد غذایی و ریشه‌های میزبان، تولید ترکیبات ضدمیکروبی، فعال‌سازی مکانیسم‌های دفاع گیاه همراه با ایجاد تغییرات ریخت‌شناختی در ریشه مانند ضخیم شدن دیواره‌های سلولی از طریق لیگنینی شدن و تولید پلی‌ساکاریدهای دیگر جهت جلوگیری از نفوذ و رشد عوامل بیماری‌زا و کاهش تراوش‌های ریشه که به کمتر شدن کشش شیمیایی بیمارگر به سمت ریشه یا کاهش جوانه‌زنی زادمایه‌های بیمارگر منجر می‌شود، در مهار بیماری‌های گیاهی توسط AMF نقش دارند (اختر و صدیقی 2007؛ آتوا 2018؛ باگیاراج 2018؛ کاستیلو و همکاران 2019). در این پژوهش، ترکیب Ri با هر یک از دو باکتری (Dt+Ri و Af+Ri) نیز سازگار بود و سبب افزایش رشد گیاه و کاهش شدّت بیماری شد اما نسبت به کاربرد جداگانه این عوامل فاقد اثر هم‌افزا در بهبود رشد یا کنترل زیستی بود که با یافته‌های ایمپریالی و همکاران (2017) مطابقت دارد. تیمار ترکیبی میکوریز و دو باکتری (Af+Dt+Ri) نیز با وجود کاهش علائم نکروز ریشه، فاقد اثر افزایشی بوده و اثری در بهبود رشد نخود نداشت. در مقابل، در برخی تحقیقات، تعاملات هم‌افزا بین AMF و PGPR و افزایش حفاظت زیستی علیه بیماری‌های خاکزاد (باگیاراج، 2018) یا بهبود شاخص‌های رشدی گیاه (محمد و همکاران 2019) مشاهده شده و برخی پژوهشگران علت آن را چنین بیان کرده‌اند که تعاملات زیرزمینی میان ریشه‌های گیاه، AMF و PGPR ممکن است سلامت و رشد گیاه را از طریق تأثیرات مکمل و هم‌افزا بر حل شدن و جذب مواد غذایی و نیز فعال کردن مسیرهای دفاع چندگانه و افزایش القای مقاومت سیستمیک در میزبان در برابر بیمارگرها بهبود بخشد (پرز-دِلوکوه و همکاران، 2017). نقش باکتری­هایی از گروه­های تاکسونومیکی مختلف به عنوان حامی میکوریز گزارش شده است. از جمله جنس‌‌های شناخته شده  Azospirillum، Azobacter، Burkholderia، Bradyrhizobium، Pseudomonas، Rhizobium، Bacillus،Paenibacillus ، Streptomyces و Arthrobacter (دیویاو و لابه 2016) اما بر اساس بررسی نگارندگان، گزارشی از تعامل مثبت با میکوریز در مورد Delftia و Alcaligenes منتشر نشده است.

با وجود این که گزارش‌های مختلفی مبنی بر اثر ترکیب گونه‌های تریکودرما و AMF بر بهبود رشد گیاه و کارایی کنترل زیستی علیه بیمارگرهای خاکزاد وجود دارد (مارتینز-مدینا و همکاران 2009؛ سریواستاوا و همکاران 2010؛ یوان و همکاران 2016)، در پژوهش حاضر، تیمارهای ترکیب میکوریز و تریکودرما روی بیشتر صفات رشدی بررسی شده اثر مثبتی نداشتند. به عنوان مثال، ترکیب Ta+Ri به‌جز وزن تر اندام‌هوایی، نقشی در بهبود پارامترهای رشدی نداشت و تنها سبب کاهش علائم بیماری آن هم بدون اثر هم‌افزا نسبت به کاربرد جداگانه این عوامل گردید. این پدیده در گزارش های مختلفی ذکر شده است. کاستیلو و همکاران دریافتند که ترکیب T. harzianum و Glomus spp. اثر افزایشی بر کاهش پژمردگی فوزاریومی موز (F. oxysporum f.sp. cubense)، نداشته و Glomus spp. به‌تنهایی کارآمدترین تیمار در کنترل این بیماری بوده است. آن‌ها بیان کردند در تیمار ترکیبی این عوامل، اثرات رقابتی T. harzianum بر سر مواد مغذی و جایگاه‌ها با اثرات مفید Glomus spp. تداخل ایجاد می‌کند (کاستیلو و همکاران 2019). تعاملات میان سویه‌های Trichoderma و AMF و تأثیرشان بر رشد گیاه و مهار بیماری ممکن است توسط خصوصیات ذاتی گونه‌ها یا حتی سویه‌های هر دو قارچ تحت تأثیر قرار گیرد (مک‌آلیستر و همکاران 1994؛ یوان و همکاران 2016). به عنوان مثال از میان سه گونه T. harzianum،  T. viride و T. virens تنها T. harzianum تعامل مثبتی با میکوریزها جهت افزایش رشد لوبیای سودانی و مهار فوزاریوم آن برقرار نموده است (دهاریا و همکاران 2015). البته برهم­کنش T. harzianum هم با G. intraradices مثبت بود ولی با گونه‌های دیگر میکوریز تعامل منفی داشت (مارتینز-مدینا و همکاران، 2009). همچنین Rhizophagus irregularis و T. viride به تنهایی عملکرد خوبی داشتند ولی در تلفیق با هم رشد گیاه را کاهش دادند. در حقیقت هر دو قارچ روی کلنیزاسیون یکدیگر اثر منفی داشتند و حضور گیاه در بروز این اثر منفی مهم بود (لاگوس و همکاران 2018). در حقیقت سویه­های میکروبی با تداخلات هورمونی می­توانند رشد و مقاومت گیاه را کاهش دهند (کورن‌نیف و پیترسه 2008) در مورد T. asperellum هم تعامل منفی آن با میکوریزها در رشد کاکائو مشاهده شده است (تچامنی و همکاران 2011). گفته شده که کمک قارچ‌ها و باکتری‌ها به حلالیت فسفات، نرخ کلنیزاسیون میکوریز را کاهش می‌دهد (تچامنی و همکاران 2011؛ لاگوس و همکاران 2018).

در تحقیق حاضر، در ترکیب هر کدام از دو سویه باکتریایی با Ri و Ta، نتیجه متفاوتی مشاهده شد، تیمار حاوی Dt (Dt+Ri+ Ta) علاوه بر کاهش شدّت بیماری، سبب بهبود برخی فاکتورهای رشدی نخود (رشد طولی ریشه و وزن تر اندام‌هوایی) گردید اما ترکیب دارای Af (Af+Ri+Ta)، اثری بر مهار بیماری یا افزایش رشد گیاه نداشت. چیارینی و همکاران (1998) بیان نموده‌اند که سویه‌های منفرد میکروبی ممکن است در حضور سایر مایه‌های میکروبی، به یک میزان رشد خوبی نداشته باشند. همچنین در این پژوهش، ترکیب دو باکتری با تریکودرما و میکوریز (Af+Dt+Ri+Ta) فقط سبب کاهش بروز بخشی از علائم بیماری (نکروز ریشه) گردید و اثری در بهبود رشد نخود نداشت. این نتایج با گزارش‌های برخی محققین (سریواستاوا و همکاران 2010؛ دوک و همکاران 2017) مبنی بر مزایای بیشتر ترکیب AMF، Trichoderma و PGPR نسبت به کاربرد جداگانه آن‌ها و اثر هم‌افزای ترکیبشان در مهار بیماری و افزایش رشد گیاه مغایرت دارد.

برهم­کنش‌ها و روابطی که میان گیاهان-میکروارگانیسم‌ها و نیز میکروارگانیسم‌های مختلف با یکدیگر ایجاد می‌شود، بسیار پیچیده بوده و به شکل شبکه‌ای از روابط چندگانه و متقابل با اثرات گوناگون است. بنابراین رفتار عوامل زیستی به‌تنهایی، در مقایسه با زمانی که عوامل پیرامونی دیگر نظیر سایر عوامل میکروبی وجود دارند، ممکن است به دلیل تعامل متقابل با آن عوامل، بسیار متفاوت باشد. این امکان وجود دارد که افزوده شدن یک عامل میکروبی خاص به یک سیستم، ماهیت روابط میان موجودات قبلی را تغییر دهد و یا اثر PGPR یا PGPF روی پاسخ‌های دفاعی گیاه با حضور سایر میکروارگانیسم‌های موجود در محیط گیاه، تحت تأثیر قرار گیرد. همچنین چون تعدادی از عوامل میکروبی قادرند مولکول‌های سیگنال یا مواد تقویت‌کننده رشد تولید شده توسط PGPR یا PGPF را تجزیه نمایند، بنابراین ممکن است روی رفتار عوامل دیگر اعم از مفید یا مضر نیز تأثیرگذار باشند. از سوی دیگر، شرایط محیطی نیز می‌توانند فیزیولوژی گیاهان را تغییر داده و یا بر نوع رابطه و یا تعامل میان PGPR یا PGPF و گیاهان میزبان آن‌ها در یک محیط تأثیر بگذارند (بنت 2006؛ احمدزاده 2013؛ منندز و پاچو 2020). علاوه بر مطالب فوق ممکن است در میان میکروارگانیسم‌های مفید مهارکننده یک بیمارگر، برخی تعاملات آنتاگونیستی مانند رقابت رخ داده و یا مواد متابولیتی تولید شده توسط باکتری‌ها یا قارچ‌های کنترل زیستی که به فعالیت آنتاگونیستی آن‌ها در برابر قارچ‌های بیماریزا کمک می‌کنند، بر سایر میکروارگانیسم‌های مفید نیز تأثیرگذار باشند (واهیونو و همکاران 2016). بنابراین طبیعی است که نتایج به‌دست‌آمده در تحقیقات مختلف و حتی در یک تحقیق (نظیر تحقیق حاضر) در ترکیب سویه‌های مختلف باکتریایی و قارچی  کاملاً متفاوت باشد. با توجه به اینکه تعاملات پیچیده که در ریزوسفر بین عوامل کنترل زیستی و میکروبیوتای بومی رخ می‌دهند، قادرند اثرات سودمند گونه‌های جداگانه را تقویت یا مهار کنند، هنگام استفاده از ترکیب عوامل زیستی باید اثرات چنین تعاملاتی را به‌دقت بررسی نموده و در طول تولید تجاری محصولات میکروبی مورد توجه قرار داد (ویپس 2001؛ پاسکوال 2016).

در این تحقیق، Ri توانست ریشه‌های نخود را به‌خوبی کلنیزه نماید (۷۴ درصد) اما در حضور بیمارگر، میزان کلنیزاسیون ریشه توسط این قارچ به ۴۵ درصد کاهش یافت. بنابراین حضور بیمارگر اثر منفی بر کلنیزاسیون ریشه گیاه توسط میکوریز داشت. سهرابی و همکاران (2015) نیز دریافتند میزان کلنیزاسیون ریشه نخود توسط R. intraradices 5/69 درصد ریشه بود که در حضور بیمارگر عامل پوسیدگی ریشه (Fusarium solani f.sp. pisi) به  25/41 کاهش یافت. F. redolens بیمارگری است که در بافت کورتکس ریشه فعال بوده و سبب نکروز ریشه می‌شود و این موضوع احتمالاً نشان‌دهنده وقوع تعاملات رقابتی بالا میان این دو قارچ است.

نتیجه‌گیری

به طور کلی در این تحقیق کاربرد عوامل باکتریایی و قارچی  به‌صورت منفرد اثر خوبی در افزایش رشد گیاه و کاهش بروز بیماری داشت. اما کاربرد دوگانه، سه‌گانه یا چهارگانه این عوامل، از لحاظ تأثیر بر این شاخص‌ها همواره کارآمد و مفید نبود. هیچ‌کدام از ترکیبات باکتریایی و قارچی  نیز اثر هم‌افزایی در بهبود رشد و کارایی کنترل زیستی نداشت. به‌هرحال با توجه به مزایای گوناگون استفاده از ترکیب میکروارگانیسم‌ها نسبت به کاربرد سویه‌های منفرد آن‌ها، حتی اگر هیچ بهبودی در کنترل بیماری یا افزایش رشد گیاه قابل‌تشخیص نباشد، ترکیب آن‌ها همچنان به دلایل متعدد دیگر از جمله کنترل بیمارگرهای متعدد، کنترل پایدارتر یا کنترل در طیف وسیع‌تری از شرایط محیطی همچنان سودمند است (لارکین و فراول 1998). با توجه به اینکه هر کدام از عوامل باکتریایی و قارچی  به‌کار رفته در این تحقیق، کارایی خوبی در کنترل زیستی و تحریک رشد داشته‌اند، توصیه می‌شود در مطالعات آینده، اثر ترکیبشان با سویه‌های مناسب و سازگار ارزیابی شود و بهترین گزینه‌ها که بتوانند در افزایش رشد و بهبود عملکرد گیاه و کاهش بیماری هم‌افزا باشند، انتخاب و جهت کاربردهای عملی در مزرعه فرموله شوند. واضح است که چنین اقدامی نه‌تنها سبب کاهش وابستگی کشاورزان به کودها و سموم شیمیایی می‌شود بلکه در کاهش هزینه‌های تولید محصولات کشاورزی و حفاظت از محیط‌ زیست و دستیابی به کشاورزی پایدار نقش به سزایی خواهد داشت (سینگ و سینگ 2013).

سپاسگزاری

نویسندگان از گروه گیاه‌پزشکی دانشکده کشاورزی (دانشگاه رازی) به دلیل تأمین امکانات گلخانه‌ای و آزمایشگاهی تشکر می‌نمایند.

[1] Integrated pest management

[2] Plant growth promoting rhizobacteria

[3] Plant growth promoting fungi

[4] ‌Arbuscular mycorrhizal fungi

[5] Nutrient agar

[6] Nutrient broth

[7] Nitrogen, Phosphorous, Potassium