نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه علوم و مهندسی خاک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران
2 گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Abstract
Background & Objective: Auxin producing plant growth-promoting bacteria can prevent the entry of heavy elements such as cadmium into the aerial section of plants. This issue was investigated using Bacillus atrophaeus in the presence and absence of tryptophan by inoculation of rye under cadmium contamination.
Materials and Methods: This experiment with 12 treatments including two bacterial levels (inoculation with B. atrophaeus and non-inoculation), two levels of the tryptophan amino acid (application and non-application) and three cadmium levels (zero, 50 and 100 mg.L-1) was performed as hydroponic culture with rye culture in factorial experiment with randomized complete design.
Results: The results showed that the co-application of tryptophan with bacterial inoculation of rye as a superior treatment reduced the entry of cadmium into its aerial section by 53 and 37% compared to the control treatment respectively at 50 and 100 mg.L-1 of cadmium. Also, the highest amount of cadmium accumulation in the roots, especially at the level of 100 mg.L-1 cadmium, was 2 times higher than the control treatment. The study of root characteristics also showed that there is the highest correlation between root cadmium concentration and root surface density and root surface density characteristics (r2=0.87).
Conclusion: In order to reduce the entry of cadmium into the shoots of rye, B. atrophaeus can be inoculated alone or with the addition of tryptophan. Due to the high accumulation of cadmium in the roots, this compound can be used in the cadmium phyto-stabilization process.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
آلودگی خاک با فلزات سنگین بهویژه کادمیوم یکی از مهمترین چالشهای زیست محیطی در سطح جهان بوده و تهدیدی جدی برای ادمه زندگی موجودات زنده محسوب میگردد. این فلز که اغلب از طریق فعالیتهای صنعتی مانند تصفیه، استخراج و تولید پلاستیک و حتی به شکل ناخالصی از طریق کودهای شیمیایی در خاک رها میشود (رحمان و همکاران 2019) در محیط زیست غیرقابل تجزیه بوده و بنابراین استمرار ورود این فلز منجر به تجمع و افزایش غلظت آن در خاک خواهد شد. این فلز در صورت ورود به سیستمهای بیولوژیکی با هدف قرار دادن آنزیمهای کلیدی در بدن جانداران فعالیتهای متابولیسمی آنها را مختل و در نهایت موجب ناتوانی و مرگ آنها خواهد گردید. با توجه به نیازهای صنعتی جوامع رو به رشد بشری که مهمترین منبع تولید آلودگی هستند، علیرغم تمام تلاشها در جلوگیری از گسترش آلودگی آن، احتمال افزایش آلودگیها دور از ذهن نبوده و لازم است راهکارهای جلوگیری از ورود آن به زنجیره غذایی بهصورت جدی مورد بررسی قرار گیرد (بهمن و همکاران 2019). اهمیت این امر زمانی آشکارتر میشود که مسئله امنیت غذایی نیز مورد توجه قرار گیرد، چرا که بر طبق پیشبینیهای صورت گرفته تا سال 2050 حدود 70 درصد تقاضا برای غذا با محوریت غلات جهت تامین غذای جمعیت جهان افزایش خواهد یافت (ویتال و همکاران 2020). به سبب محدودیت زمینهای قابل کشت، کشت گیاهان زراعی در خاکهای آلوده به عناصر سنگین و یا با توجه به محدودیت منابع آبی، استفاده از آبهای آلوده به عناصر سنگین برای آبیاری محصولات کشاورزی اجتناب ناپذیر خواهد بود (عابدی و مجیری 2020).
نتیجه تحقیقات نشان داده است که کاربرد کودهای سولفوردار، استفاده از سیلیسیم، کاربرد عنصر روی و اصلاح کنندههای آلی در خاکهای آلوده میتوانند در خصوص جلوگیری و یا کاهش ورود عناصر سنگین به گیاهان موثر واقع شوند (عابدی و مجیری 2020). موضوعی که اخیراً در کانون توجه اینگونه مطالعات قرار گرفته است استفاده از پتانسیل میکروبی خاک بهویژه تاثیر ریزوباکتریها (PGPR) است. گزارشات علمی منتشر شده بیانگر کارآمدی بالای این روش جهت جلوگیری از ورود عناصر سنگین به اندام های هوایی گیاهان در شرایط آلوده میباشند. خانا و همکاران (2019) گزارش کردند که تلقیح گیاهانBrassica juncea ، Luffa cylindrica و Sorghum halepense با باکتری باسیلوس مگاتریوم توانست جذب و انتقال فلز سنگین نیکل را کاهش دهد. همچنین، تلقیح با Neorhizobium huautlense T1-17، علاوه بر بهبود رشد تربچه و کلم چینی در حضور کادمیوم، جذب و تجمع این عنصر در این گیاهان را کاهش داد. مکانیسمهای عمل باکتریها برای انجام اینکار بسیار متعدد هستند، راجکومار و همکاران (2013) یکی از دلایل این امر را تولید هورمون اکسین توسط اینگونه باکتریعنوان میکنند چرا که اکسین با دخالت در ایجاد لیگاندهایی که قادرند با اتصال به کادمیوم، موجب ترسیب آن در ریشه شده و مانع انتقال به اندام هوایی شوند. علاوهبر این، مقادیر بالای کادمیوم موجب اختلال در بیوسنتز و عملکرد پروتئینهای مسئول انتقال و توزیع اکسین در گیاه، افزایش تولید اتیلن (راجکومار و همکاران 2013) و افزایش تولید اکسید نیتریک (یانگ و هونگ 2016) تولید و توزیع هورمون اکسین در گیاه را مختل مینماید. کاربرد اکسین خارجی میتواند محدودیتهای متابولیسمی ایجاد شده در بیوسنتز اکسین در اثر تجمع کادمیوم را برطرف نموده و از تاثیر منفی این عنصر بر گیاه بکاهد. افزایش ماده خشک ریشه و اندامهای هوایی آفتابگردان در یک خاک آلوده به سرب پس از افزودن فیتوهورمون ایندول استیک اسید مشاهده شده است (لیپادزی و همکاران 2006). همچنین، تاثیر مثبت ایندول استیک اسید خارجی بر رشد Brassica juncea در مقادیر بالای آرسنیک گزارش شده است (سرویستاوا و همکاران 2013). فاروق و همکاران (2015) اظهار داشتند که افزودن سطوح مختلف تریپتوفان، به محیط اطراف ریشه بوتههای برنج سبب رشد بهتر و تولید بیشتر این گیاه در خاکهای آلوده به کادمیوم شده و باعث افزایش رشد گیاه و عملکرد، تحت تنش کادمیوم همراه با کاهش انتقال عنصر به بخش هوایی شده است.
تریپتوفان پیشماده ساخت هورمون اکسین در گیاهان و باکتریهای موجود در ریزوسفر است (دال کورسو و همکاران 2019). بخش قابل توجهی از تریپتوفان مورد نیاز ریزوباکتریها از هیدرولیز پروتئینهای موجود در ماده آلی خاک و بخش کمی نیز از ترشحات ریشه تامین میشود و مشخص شده که نوع باکتری و گیاه میزبان بههمراه میزان وجود تریپتوفان بر مقدار تولید اکسین اثرگذار هستند. مصطفی و همکاران (2018) گزارش نمودند که بین میزان تریپتوفان موجود و اکسین تولید شده ارتباط مستقیم وجود دارد. دسوزا و همکاران (2015) نیز گزارش نمودهاند که افزودن تریپتوفان به خاک میتواند باعث افزایش تولید اکسین توسط PGPRها شود. پائین بودن ماده آلی خاک و یا هر فاکتور اثرگذار بر تامین کافی تریپتوفان میتواند تولید اکسین توسط ریزوباکترها را با محدویت مواجه نماید. با توجه به مطالب ذکر شده به نظر میرسد که بتوان با عرضه تریپتوفان به خاک در راستای رفع اختلال ایجاد شده در بیوسنتز اکسین در پی تجمع کادمیوم استفاده نمود.
علاوه بر اکسین، یکی دیگر از ویژگیهای مهم مطرح در باکتریها که در سالهای اخیر مورد توجه قرار گرفته است، تولید بیوفیلم است. باکتریهای تشکیل دهنده بیوفیلم از این ویژگی برای مقاومت در برابر شرایط نامساعد محیطی مانند تنش فلزات سنگین و کمآبی بهره برداری میکنند. تشکیل بیوفیلم باکتریایی در سطح ریشه گیاهان همچنین میتواند با جذب فلزات مانع ورود آنها به ریشه گیاه شود، لذا، میتوان از اینگونه باکتریها جهت تلقیح به گیاهان در شرایط آلودگی برای جلوگیری از ورود فلز به اندامهای هوایی بهرهبرداری نمود (وربورگان و همکاران 2009).
در این مطالعه سعی شده است تا تاثیر افزودن تریپتوفان به خاک به همراه باکتری بیوفیلمی مولد اکسین (Bacillus atrophaeus 54-1) بر جذب کادمیوم و انتقال آن به بخش هوایی در گیاه چاودار (Secale cereale L.) بهعنوان یک گیاه مهم در تغذیه انسان و دام مورد مطالعه قرار گیرد.
مواد و روشها
انتخاب باکتری و ارزیابی مقاومت آنها به فلز کادمیوم
در این مطالعه چهار باکتری با قابلیت تولید بالای اکسین میکروبی با اسامیBacillus simplex 32-1, Bacillus simplex 40-1, Bacillus atrophaeus 54-1, Bacillus simplex 52-2، استفاده شد (کریمی و همکاران 2019). باکتریهای مذکور از ریزوسفر گرامینههای علفی و غیرزراعی منطقه هشترود واقع در استان آذربایجانشرقی جداسازی شده و در مجموعه باکتریایی آزمایشگاه بیولوژی خاک دانشگاه مراغه نگهداری میشوند.
برای ارزیابی مقاومت باکتریهای مورد مطالعه به کادمیوم، محیط کشت نوترینت آگار محتوی مقادیر صفر (شاهد)، 50، 100، 200، 300 و 400 میلیگرم در لیتر کادمیوم از منبع کلرید کادمیوم تهیه و باکتریها بهصورت نقطهای در آنها کشت گردیدند. ظروف کشت باکتریها بهمدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد نگهداری شده و رشد کلنیها بهصورت چشمی مورد ارزیابی قرار گرفت.
اندازهگیری میزان تولید اکسین توسط باکتریها در محیط کشت LB و در حضور ترشحات ریشه چاودار
مقدار 200 میکرولیتر از باکتریهای 12 ساعت کشت شده در محیط LB مایع، به محیط کشتهای LB و عصاره استریل ریشه که یک سری حاوی 5 میلیمولار تریپتوفان و سری بعدی که فاقد آن بودند، بهصورت جداگانه منتقل شده و پس از 72 ساعت میزان تولید اکسین با استفاده از معــرف سالکوفسـکی (شــامل 150 میلیلیتر اسید سولفوریک غلیظ، 250 میلیلیتر آب مقطر و 7/5 میلـی‌لیتـر کلریـد آهـن (FeCl3.6H2O نــیم‌مــولار) با استفاده از اسپکتروفتومتر، در طول موج 535 نـانومتر اندازه گیری شد. از ایندول استیک اسید بهعنوان استاندارد استفاده گردید.
مطالعات گلخانهای
ادامه پژوهش با استفاده از باکتری Bacillus atrophaeus 54-1 بههمراه تریپتوفان (با غلظت 100 میلیگرم بر لیتر) انجام گرفت. در این مرحله بهمنظور بررسی تاثیر کاربرد اسید آمینه تریپتوفان به همراه حضور باکتری محرک رشد در جذب کادمیوم توسط چاودار، آزمایش گلدانی و هیدروپونیک بهصورت فاکتوریل بر پایه طرح کامل تصادفی در چهار تکرار و با تیمارهای زیر انجام شد: سه سطح کادمیوم (صفر، 50 و 100 میلیگرم در لیتر)، دو سطح تیمار باکتریایی ( مایهزنی باکتری B. atrophaeus 54-1 و عدم مایهزنی) و دو سطح اسید آمینه تریپتوفان (عدم کاربرد و کاربرد با غلظت 100میلی گرم در لیتر ( اعتصامی و همکاران 2009)). پرلیت مورد استفاده در کشت هیدروپونیک با اتوکلاو استریل شده و بذور چاودار گندزدایی شده (بهمدت 10 دقیقه در وایتکس 2 درصد و سپس 40 ثانیه در الکل 70 درصد) پس از مایهزنی با باکتری در این بستر کشت شدند. محلول هوگلند برای آبیاری و تغذیه استفاده گردیده و پس از ظهور جوانهها و یکسان سازی تعداد بوتهها در تمامی گلدانها ( 7 روز پس از شروع آزمایش) تیمارهای عنوان شده با افزودن عنصر سنگین کادمیوم و تریپتوفان همراه با محلول هوگلند اعمال شدند. تنظیم رطوبت گلدانها بهصورت وزنی و با ترازو با دقت بالا انجام شد. لازم به ذکر است که جهت جلوگیری از ورود احتمالی کادمیوم توسط زه آب گلدانها به سایر آنها تمامی گلدانها دارای زیر گلدانی بودند.
اندازهگیری خصوصیات ریشه چاودار
پس از اتمام آزمایش پرلیت گلدانها به آرامی خارج شده و پس از تکاندن ملایم ریشهها، در داخل غربال با فشار آب شهری کاملا تمیز شسته شده و آب اضافی ریشهها با دستمال کاغذی گرفته شد. وزن تر ریشهها با ترازوی دقیق تعیین شده و حجم ریشهها با انداختن ریشه تازه در حجم مشخصی از آب در درون استوانه مدرج و تفاوت حجم اولیه با حجم ثانویه بدست آمد. سپس ریشهها در داخل آون با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفته و پس از 24 ساعت جهت اندازهگیری وزن خشک ریشه، با ترازو توزین شدند. سایر خصوصیات ریشه به شرح زیر محاسبه گردید (اخوان و همکاران 1391):
|
رابطه (1) |
حجم ریشه (cm-3) ÷ وزن خشک ریشه (g)= چگالی بافت ریشه[1] (g.cm-3) |
|
رابطه (2) |
89/0 × وزن ریشه (g) =طول ریشه [2] (m) |
|
رابطه (3) |
5/0 ( طول ریشه (cm) × π × حجم ریشه (cm-3))2= سطح ریشه[3] (cm2.cm-2) |
|
رابطه (4) |
5/0(π × طول ریشه (m)) ÷ وزن تر ریشه (g) × 4) = قطر ریشه[4] (mm) |
|
رابطه (5) |
(π × طول ریشه (m) × قطر ریشه (mm))= چگالی سطح ریشه[5] (cm2.cm-3) |
اندازهگیری وزن تر و خشک اندامهای هوایی
برای این منظور اندام هوایی گیاه (ساقه، سنبله و برگ) در دمای 60 تا 70 درجه سانتیگراد در آون خشک شده و سپس با ترازوی دقیق توزین گردیدند.
اندازه گیری میزان کادمیوم در ریشه و اندام چاودار
برای این منظور مقدار 5/0 گرم ماده خشک کل ریشه و کل اندام هوایی بهصورت جداگانه برداشت شده و پس از هضم با روش تر، غلظت کادمیوم در این بافتها با دستگاه جذب اتمی مورد اندازهگیری قرار گرفت.
دادههای به دست آمده از این تحقیق پس از آزمون نرمال بودن دادهها با استفاده از نرم افزار MSTATC تجزیه آماری شدند. مقایسه میانگین دادهها با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج و بحث
ارزیابی مقاومت به فلزات سنگین در باکتریهای مورد استفاده
باکتریها در غلظت 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم به خوبی رشد کردند. اما در غلظت 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم رشد آنها بسیار کم شده و حتی در غلظتهای 300، 400 و 500 میلیگرم در لیتر این فلز، باکتریهای مورد مطالعه نتوانستند رشد کنند (شکل 1). بر اساس ارزیابیهای چشمی از اشکال کلنی باکتریها دو باکتری B. simplex 32-1 و B. atrophaeus 54-1 جهت ادامه کار انتخاب شدند. طبق بررسیهای انجام یافته روی این باکتریها توسط کریمی و همکاران (2019)، این باکتریها در زمره قویترین تولید کنندگان بیوفیلم باکتریایی هستند. بیوفیلم میکروبی یک عامل محافظتی در برابر شرایط نامطلوب محیطی بهویژه عناصر سنگین محسوب میشود، لذا مقاومت آنها در غلظت بالای کادمیوم دور از انتظار نبود.
|
|
|
شکل 1- ارزیابی توانایی رشد باکتریها مورد مطالعه در محیط کشت NA حاوی غلظتهای مختلف کادمیوم (صفر، 50، 100، 200، 300، 400 و 500 میلیگرم در لیتر کادمیوم). B1باکتریB. simplex 32-1 ، B2 باکتریB. simplex 40-1 ، B3 باکتری B. simplex 52-2و B4 باکتریB. atrophaeus 54-1 میباشد. |
ارزیابی تولید اکسین توسط باکتریهای منتخب در حضور ترشحات ریشه گیاه چاودار
میزان تولید اکسین بطور معنیداری تحت تاثیر نوع باکتری و محیط کشت در سطح احتمال یک درصد قرار گرفت (جدول 1). مقایسه میانگین تیمارهای آزمایشی نشان داد که بیشترین میزان اکسین در حضور باکتری B. atrophaeus 54-1 تولید گردید که نسبت به باکتری B. simplex 32-1 7/37 درصد اکسین بیشتری را تولید کرد (شکل 2). همچنین، در بین محیط‌های کشت، در محیط کشت شامل ترشحات ریشه چاودار بههمراه تریپتوفان 6/90 درصد اکسین بیشتر نسبت به محیط کشت LB بههمراه تریپتوفان تولید شد (شکل 3).
جدول 1- تجزیه واریانس اثر سویه‌های مختلف باکتری باسیلوس و محیط کشت بر میزان تولید اکسین
|
منابع تغییر |
میانگین مربعات |
|
|
درجه آزادی |
میزان اکسین |
|
|
سویه ی باکتری |
2 |
001/0** |
|
محیط کشت |
1 |
003/0** |
|
باکتری × محیط کشت |
2 |
002/0ns |
|
خطا |
12 |
0001/0 |
|
ضریب تغییرات (%) |
|
2/25 |
**معنیدار در سطح یک درصد، * معنیدار در سطح پنج درصد و ns غیر معنیدار می باشد.
ارزیابی انجام شده در خصوص توانایی تولید اکسین توسط باکتریهای مورد مطالعه نشان داد که اکسین در محیط کشت LB زمانی تولید میشود که تریپتوفان به آن افزوده گردد. هیچکدام از باکتریها قادر نبودند در محیط کشت LB فاقد تریپتوفان اکسین تولید کنند (شکل 2). نتیجه مشابهی نیز در محیط ترشحات ریشه بهعنوان شبیه سازی شرایط واقعی به دست آمد و اکسین زمانی توسط باکتریها تولید شد که تریپتوفان در اختیار آنها قرار گرفت (شکل 2). از آنجایی که تریپتوفان در اغلب موارد پیش ماده ساخت اکسین میباشد (احمد و کیبرت 2014). بنابراین، عدم تولید آن در شرایط بدون تریپتوفان طبیعی به نظر میرسد. بر طبق نظر محققان 10 تا 40 درصد تولیدات فتوسنتزی گیاه، به صورت ترشحات ریشه، از ریشه گیاه دفع میگردد که این مواد بخوبی میتوانند رشد باکتری را حمایت کنند و بواسطه وجود این ترشحات، محیط ریزوسفر گیاهان در خاک یکی از غنیترین محیطها برای رشد میکروبهای خاک به شمار میرود (مو 2013). نتایج این مطالعه نشان داد که اگر چه ترشحات ریشه چاودار بخوبی میتواند موجبات رشد باکتریها را فراهم کند اما تولید اکسین زمانی مشاهده گردید که تریپتوفان در اختیار باکتری قرار گرفت و به همین دلیل احتمال اینکه تریپتوفان در ترشحات ریشه چاودار وجود نداشته باشد، بالا میباشد، که همسو با نتیجه مطالعات کاوازاکی و همکاران (کاوازاکی و همکاران 2016) مبنی بر عدم ترشح تریپتوفان از ریشه گیاه میباشد. با استناد به یافتههای این بخش باکتریB. atrophaeus 54-1 جهت انجام آزمون گلخانهای انتخاب شد.
مطالعات گلخانهای
تجمع کادمیوم در ریشه و ساقه
نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که تاثیر تیمارهای آزمایشی بر میزان جذب و تجمع کادمیوم در ریشه و ساقه معنیدار هستند ( جدول2). بر اساس نتایج مقایسات میانگین ( شکل4) با توجه به هیدروپونیک بودن کشت و استفاده از مواد خالص غلظت کادمیوم در سطح صفر کاربرد آن، صفر بوده و کادمیوم در ریشه و اندام هوایی مشاهده نشد. در سطح 50 میلیگرم بر لیتر کادمیوم، اگر چه غلظت کادمیوم در ریشه در تیمارهای آزمایشی تغییرات معنی داریرا نشان نداد ولی غلظت کادمیوم در اندام هوایی چاودار به طرز محسوسی در تیمار تریپتوفان به همراه مایهزنی باکتریایی در مقایسه با سایر تیمارها کاهش یافت. در غلظت 100 میلیگرم بر لیتر کادمیوم، بیشترین میزان کادمیوم در ریشه در تیمارهای باکتریایی مشاهده گردید که در حضور تریپتوفان نسبت به عدم حضور آن این میزان زیادتر شده بود. نظیر آنچه که در سطح 50 میلیگرم بر لیتر کادمیوم در اندام هوایی چاودار مشاهده شد، کمترین میزان کادمیوم در این غلظت از کادمیوم در تیمار مایه زنی باکتری به همراه کاربرد تریپتوفان اتفاق افتاد.
|
|
|
شکل 4- تاثیر تیمارهای آزمایشی بر روند تجمع کادمیوم در ریشه و اندام هوایی چاودار. Cd0 ،Cd50 و Cd100 به ترتیب بیانگر غلظتهای صفر،50 و100میلیگرم در لیتر کادمیوم، (Trp-) و (Trp+) به ترتیب بیانگر غلظت صفر و 100 میلیگرم در لیتر تریپتوفان، B0 تیمار بدون مایهزنی باکتریایی و B1 باکتری (B. atrophaeus 54-1) میباشد. میانگینهای دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد اختلاف آماری معنادار هستند.
نتایج بررسی در شکل 5 نشان داد که همبستگی بالایی میان جذب و تجمع کادمیوم در ریشه با میزان آن در ساقه وجود دارد. این رابطه از نوع درجه دوم بوده و می توانست 90 درصد از تغییرات به وجود آمده در غلظت کادمیوم در اندام هوایی گیاه چاودار را با توجه به غلظت آن در ریشه توجیه نماید.
شکل 5 - رابطه رگرسیونی بین غلظت کادمیوم در ریشه با غلظت آن در ساقه گیاه چاودار
وانگ و همکاران (2018) کاهش 12 تا 32 درصدی کادمیوم در اندام هوایی گندم و همچنین کاهش 15 تا 28 درصدی کاهش دسترسی کادمیوم در خاک ریزوسفری را توسط تلقیح باکتریهای Ralstonia eutropha Q2-8 وExiguobacterium aurantiacum Q3-11 گزارش کردهاند. جان و همکاران (2019) برای کاهش تجمع کادمیوم در برنج از باکتریهای Exiguobacterium indicum SA22 و Enterobacter ludwigii SAK5 استفاده کردند. احمد و کیبرت (2019) گزارش کردهاند که ازRhizobium ،Bradyrhizobium ، Pseudomonas وStenropothomonas acidaminiphila میتوان در کاهش تجمع فلز در گیاهان استفاده کرد. نتایج این تحقیق نیز نشان داد که در سطح کادمیوم 50 میلیگرم در لیتر تیمارهای تلقیح باکتریایی، تریپتوفان، باکتری به همراه تریپتوفان بهترتیب تجمع کادمیوم در گیاه چاودار را 14 درصد، 21 درصد و 53 درصد کاهش دادند. این مقادیر در تیمار 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم به ترتیب برابر بودند با 9، 18 و 37 درصد. صرف‌نظر از سایر مکانیسمهای احتمالی مقاومت به فلزات سنگین در باکتریها، بر طبق نتایج کریمی و همکاران (2019) باکتری B. atrophaeus 54-1 یک باکتری بیوفیلمی بوده و قادر به تولید بیوفیلم در ریزوسفر گیاهان حین فرآیند کلنیزاسیون ریشه گیاه میباشد. بنابراین، میتواند فلز را در سطح ریشه جمع نموده و مانع ورود آن به داخل گیاه گردد که میتواند بیانگر توجیه کادمیوم زیاد ریشه در مقایسه با شرایط کنترلی این آزمایش باشد (8/1 برابر). متحرک‌سازی فلز سنگین در محیط، جذب از طریق ریشه، بارگیری در آوند چوبی، انتقال از ریشه به ساقه و درنهایت ترسیب درون‌سلولی مجموعهای از فرآیندها در تجمع فلزات سنگین در گیاهان میباشند. فلزات ابتدا در سطح ریشه جذب شده و از طریق مسیرهای آپوپلاستیک (انتشار غیرفعال) و سیمپلاستیک (انتقال فعال در برابر شیبهای بالقوه الکتروشیمیایی و غلظت در غشای پلاسما) به داخل ریشه نفوذ پیدا میکنند. مسیر سیمپلاستیک راه متداول جذب فلزات سنگین و وابسته به انرژی بوده که توسط حاملهای یون فلزی صورت میگیرد. یونهای فلزات سنگین پس از ورود به سلولهای ریشه میتوانند با کلاتورهای مختلف، مانند اسیدهای آلی، تشکیل کمپلکس داده و به اشکال کربنات، سولفات و فسفات ترسیب یافته و پس از آن در فضای خارج سلول (فضای آپوپلاستیک) یا فضاهای داخل سلولی (مانند واکوئل ها) بیحرکت شوند (کلمن و همکاران 2016). هورمونهای گیاهی به عنوان پیام رسانهای شیمیایی با تنظیمات بسیار پیچیده به گیاهان اجازه میدهند تا در طول رشد، انعطاف پذیری رشدی را حفظ کنند و از طریق مکانیسمهای متعددی قادرند جذب، انتقال و ترسیب فلز سنگین در واکوئل بواسطه نقششان در تولید لیگاندهای فیتوکلاتین و متالوتیونین بر روند جذب فلز سنگین در گیاه پالایی تاثیر گذار باشند (کلمن و همکاران 2016). علاوه بر این ممانعت از ساخت کامل دیواره کاسپارین در سلولهای ریشه و تغییر جریانات رایج ریشه از جریان سیمپلاستی به نفع جریان آپوپلاستی از اثرات هورمون اکسین میباشد (سرگین و ایوانو 1997). هورمون اکسین از پیش ماده تریپتوفان توسط گیاه و باکتری تولید میشود. بنابراین، افزایش کادمیوم ریشه در اثر کاربرد تریپتوفان و تریپتوفان به همراه باکتری میتواند ناشی از این امر نیز باشد.
تاثیر تیمارهای آزمایشی بر خصوصیات ریشه
نتایج تجزیه واریانس دادهها در جدول 1 نشان داد که اثر متقابل کادمیوم×تریپتوفان×باکتری بر 9 ویژگی بررسی شده ریشه در این مطالعه شامل حجم ریشه، وزن‌تر ریشه، درصد رطوبت وزنی ریشه، سطح ریشه، قطر ریشه و چگالی ریشه در سطح احتمال یک درصد و بر چگالی بافت ریشه، وزن خشک‌ریشه و طول ریشه در سطح احتمال 5 درصد معنیدار بود. نتایج مقایسه میانگینها تأثیر تیمارها بر ویژگیهای ریشه در جدول 3 نشان داده‌شده است. با توجه به اینکه تیمار کاربرد تلفیقی تریپتوفان بعلاوه مایهزنی باکتریایی بیشترین میزان تجمع کادمیوم را دارا بود، بررسی دادهها نشان داد که بیشترین میزان درصد رطوبت وزنی ریشه، قطر ریشه و چگالی سطح ریشه در این تیمار مشاهده گردید. اگرچه این تیمار بر چگالی بافت ریشه در غلظت 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم تاثیر معنیداری نداشت. ولی در غلظت 100 میلیگرم بر لیتر کادمیوم بیشترین مقدار این صفت مربوط به این تیمار بود. سطح ریشه در این تیمار نسبت به تیمار کنترل در غلظت 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم کاهشی بوده ولی در تیمار 100 کادمیوم روند افزایشی را نشان داد. طول ریشه در این تیمار نسبت به تیمار کنترل در سطح 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم کاهشی بوده ولی در تیمار 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم بر این ویژگی بیتاثیر بود. هرچند وزن‌تر و وزن خشک‌ریشه در این تیمار در تمامی سطوح کادمیوم نسبت به تیمار کنترلی هر سطح روندی کاهشی را نشان داد، اما حجم ریشه در این تیمار در سطح 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم افزایش چشمگیری داشت (جدول 3).
همبستگی میان صفات ریشه با تجمع کادمیوم در آن
بررسی روابط بین ویژگیهای ریشه با میزان کادمیوم انباشت شده در ریشه نشان داد (شکل 6) که همبستگی بالایی میان آنها وجود دارد. این همبستگی خطی نبوده و بهصورت توابع درجه دوم میباشد. کمترین ضریب همبستگی بین میزان کادمیوم با درصد رطوبت وزنی ریشه و قطر ریشه به ترتیب با مقادیر 4/0 و 42/0 بود و بیشترین همبستگی با خصوصیات سطح ریشه و چگالی سطح ریشه با مقادیر یکسان 87/0 مشاهده گردید.
ریشهها نقشی حیاتی در جذب آب و مواد غذایی دارند و اولین نقطه برخورد گیاه با عنصر سنگین در خاک به شمار میروند. بنابراین اطلاع از رفتار ریشه و خصوصیاتی از آن‌که میتوانند در زمینه جذب و تجمع فلزات سنگین موثر باشند، نه‌تنها در گزینش گیاه مناسب و اصلاح آن جهت کشت در زمینهای آلوده به کادمیوم مهم به شمار میروند بلکه میتوانند در تبیین مدلهای کارآمد برای پیش‌بینی رفتار جذب گیاهان نیز مورد استفاده قرار گیرند. نتیجه قرار گرفتن گیاه در معرض تنشهای مختلف محیطی مانند فلزات سنگین بروز اختلالات متابولیسمی و کاهش رشد قسمت‌های مختلف گیاه مانند ریشه گیاه خواهد بود (بگوم و همکاران 2019). اثرات تنش فلزات سنگین همچون تنش خشکی در سه مرحله بروز خواهند یافت که مرحله نخست در سطح ارگانیسمی بر بیومس و آللومتری ریشه گیاه خواهد بود، چرا که حفظ و توسعه ریشه نیازمند سرمایه‌گذاری متابولیکی بوده و میتواند بالغ بر 50 درصد از مواد فتوسنتزی را مصرف کند (لامبرز و همکاران 2002). با کاهش میزان فتوسنتز و کاهش سهم ریشه از آسیمیلات‌ها، وزن‌تر و خشک‌ریشه نیز کاهش پیدا خواهد کرد (کرون و ویسر 2003) و نهایتاً موجب کاهش وزن خشک و تر ریشه خواهد شد، لذا کاهش 25 درصدی وزن خشک‌ریشه تک بوته چاودار در این مطالعه (از 86/0 گرم به مقدار متوسط 64/0 گرم) در تیمارهای آلوده به کادمیوم دور از انتظار نخواهد بود. بروز تنش کادمیوم در گیاه چاودار وزن‌تر ریشه تک بوته چاودار در این مطالعه را از 29/9 گرم به 58/5 گرم در سطح 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم و 30/4 گرم در سطح 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم کاهش داد. در نتیجه این تغییرات حجم ریشه تک بوته چاودار در این مطالعه از gr.cm-3 75/5 به رقم 50/3 در سطح 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم و 88/1 در سطح 100 میلیگرم در لیتر کادمیوم کاهش یافت. دومین تغییر حاصل از اختلالات متابولیسمی در سطح اندامی بر قطر ریشههای ریز، طول ریشه، سطح ویژه ریشه و چگالی بافت ریشه خواهد بود. بر اساس نتایج این مطالعه درصد رطوبت وزنی ریشه که بیانگر شادابی و فعال بودن ریشههاست، در شرایط تنش کادمیوم نسبت به تیمار کنترل 5/2 برابر کاهش یافت. چگالی بافت ریشه در شرایط تنش کادمیوم افزایش یافت و در سطح 100 میلیگرم در لیتر به میزان 4/2 برابر تیمار شاهد رسید. طول ریشه، سطح ریشه، چگالی سطح ریشه و قطر ریشه نیز در تیمارهای آلوده به کادمیوم به‌طور چشمگیری کاهش پیدا نمودند (جدول 3). سومین مورد از تغییرات در سطح سلولی و بافتی بوده و مربوط به قطر آوندهای چوبی و ریشهها است که در این مطالعه به دلیل محدودیت امکانات بررسی نگردیدند. بااین‌حال تغییرات در قطر آوندهای چوبی یکی از دلایل تغییرات در چگالی بافتی ریشه عنوان گردیده است (اسپری و همکاران 2003).
به‌طورکلی در شرایط تنش چندین خصوصیت مورفولوژیکی برای بخش‌های ریزودرشت ریشه گزارش شده است که منجر به افزایش تولید میگردد. به نظر میرسد خصوصیات کلیدی در این زمینه خصوصیاتی هستند که بر طول کل و میزان سطح ریشه تاثیر گذارند و شامل قطر ریشه، چگالی بافت ریشه، طول ویژه ریشه و سطح ویژه ریشه میباشند. در این ارتباط قطر ریشه و چگالی بافت ریشه کنترل کننده طول و سطح سیستم ریشه‌ای برای مقدار مشخصی از زی‌توده اختصاص داده شده به ریشه میباشد (فورت و همکاران 2013) که مبنای معادلات استفاده شده در بخش مواد و روشها قرار گرفته و تاثیر آنها نیز اعمال گردیده است. تیمارهای آزمایشی توانستند بر این صفات تاثیر داشته باشند و شدت این اثر و روند آن وابسته به غلظت کادمیوم بود. در آزمایش حاضر (جدول 3)، چگالی بافت ریشه در تیمارهای مایهزنی شده با باکتری نسبت به شاهد بدون مایهزنی در تیمار 50 میلیگرم در لیتر کادمیوم افزایشی بوده و در شرایط کادمیوم 100 میلیگرم در لیتر این روند کاهشی بوده که میتواند گویای اتخاذ تدابیر متفاوت بسته به غلظت فلز و نهایتاً شدت تنش باشد. به‌عبارت‌دیگر، باکتری میتواند در شرایط سخت تنش باعث افزایش حجم در واحد بیومس ریشه گردند. دانشمندان علوم کشاورزی معتقدند که کمیت زیاد ریشه الزاماً به معنی فعالیت بیشتر ریشه نیست و آن چیزی که باعث تشدید فعالیت ریشه میگردد وجود ریشههای ریز میباشد (بیروست و همکاران 2003) که اثر تیمارهای آزمایشی از این لحاظ را میتوان در خصوصیاتی مانند قطر ریشه، چگالی سطح ریشه و سطح ریشه در غلظتهای مختلف کادمیوم مشاهده کرد (جدول 3).
علیرغم عدم بررسی تغییرات فراساختاری و بافتی تیمارهای این مطالعه، مطالعات انجام شده توسط سایر محققان بیانگر اعمال تغییرات مذکور در تیمارهای بیولوژیکی هستند به‌عنوان‌مثال Bacillus pumilus INR7 قادر به افزایش رسوب لیگنین در بافت اپیدرمی ارزن است که درواقع نوعی پاسخ دفاعی گیاه به پاتوژن Sclerospora graminicola است (واشرون و همکاران 2013).
|
جدول 2- تجزیه واریانس اثر تیمارهای (کادمیوم، باکتری، تریپتوفان و اثرات متقابل آنها) بر خصوصیات مختلف ریشه چاودار |
||||||||||
|
منابع تغییر |
درجه آزادی
|
میانگین مربعات |
||||||||
|
چگالی بافت |
حجم |
وزن تازه |
وزن خشک |
رطوبت وزنی |
طول
|
سطح
|
قطر
|
چگالی سطح |
||
|
باکتری |
1 |
**028/0 |
** 755/2 |
**341/6 |
ns 003/0 |
198456** |
0022/0ns |
32/1* |
29/1** |
94/3** |
|
تریپتوفان |
1 |
**010/0 |
**297/2 |
**459/5 |
**260/0 |
472440** |
205/0** |
36/8** |
30/2** |
535/0ns |
|
کادمیوم |
2 |
**126/0 |
** 92/62 |
**294/96 |
**412/0 |
588243** |
326/0** |
2/70** |
57/3** |
4/84ns |
|
تریپتوفان×باکتری |
1 |
**016/0 |
**092/6 |
**536/31 |
ns000/0 |
568849** |
000/0ns |
73/2** |
18/3** |
4/12** |
|
کادمیوم × باکتری |
2 |
**025/0 |
ns 876/0 |
**314/4 |
*011/0 |
71083** |
008/0** |
152/0ns |
596/0** |
2/3** |
|
تریپتوفان×کادمیوم |
2 |
ns004/0 |
**218/2 |
ns418/1 |
**014/0 |
85691** |
011/0** |
68/1** |
553/0** |
29/0ns |
|
کادمیوم×تریپتوفان × باکتری |
2 |
*005/0 |
**889/3 |
**688/7 |
*009/0 |
58077** |
007/0* |
98/1** |
327/0** |
47/3** |
|
ضریب تغییرات (%) |
|
19 |
28 |
23 |
21 |
27 |
21 |
26 |
21 |
28 |
ادامه جدول 2-
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
|
|
غلظت کادمیوم در ریشه |
غلظت کادمیوم در اندام هوایی |
||
|
باکتری |
1 |
9/280 ** |
4/56 ns |
|
تریپتوفان |
1 |
4/808** |
1/276* |
|
کادمیوم |
2 |
4/11697** |
8/8757** |
|
تریپتوفان×باکتری |
1 |
97/17ns |
91/38 ns |
|
کادمیوم × باکتری |
2 |
4/134** |
4/208* |
|
تریپتوفان× کادمیوم |
2 |
7/821** |
2/237** |
|
کادمیوم × تریپتوفان × باکتری |
2 |
5/42* |
2/102 ns |
|
ضریب تغییرات (%) |
|
11 |
17 |
جدول 3- تاثیر تیمارهای آزمایشی بر میانگین صفات مورد مطالعه در غلظتهای مختلف صفر، 50 و 100 میلیگرم بر لیتر کادمیوم.
|
کادمیوم (mg.L-1) |
تریپتوفان (mg.L-1) |
باکتری |
چگالی بافت ریشه g.cm-3 |
وزن خشک‌ریشه g |
وزن‌تر ریشه g |
حجمتر ریشه cm3 |
رطوبت وزنی ریشه % |
قطر ریشه
mm |
چگالی سطح ریشه cm2. cm-3 |
سطح ریشه
cm2. cm-2 |
طول ریشه cm |
|
صفر |
100 |
تلقیح |
13/0 g |
02/1 a |
93/8a |
87/7a |
992a |
95/3a |
38/9a |
bc 38/7 |
75b |
|
عدم تلقیح |
21/0 def |
07/1 a |
42/5c |
25/5bc |
676cd |
33/3bc |
99/7b |
c84/6 |
76 b |
||
|
صفر |
تلقیح |
17/0 fg |
86/0 b |
66/6b |
87/4c |
407fg |
69/2ef |
04/8b |
b 93/7 |
95 a |
|
|
عدم تلقیح |
15/0 fg |
85/0 b |
29/9a |
75/5b |
773bc |
53/3b |
07/10a |
a 46/9 |
91a |
||
|
50 |
100 |
تلقیح |
25/0 cd |
82/0 b |
30/3de |
25/3de |
819b |
63/3b |
15/6c |
de 86/4 |
54 de |
|
عدم تلقیح |
23/0 cde |
81/0 b |
08/4d |
50/3 de |
518ef |
96/2de |
68/5c |
d 29/5 |
61 cd |
||
|
صفر |
تلقیح |
19/0 efg |
68/0 c |
19/4 d |
67/3 d |
402fg |
68/2ef |
09/6c |
d64/5 |
72 b |
|
|
عدم تلقیح |
17/0 fg |
61/0 cd |
58/5 c |
50/3 de |
302g |
39/2f |
48/5c |
d 44/5 |
73b |
||
|
100 |
100 |
تلقیح |
25/0 cd |
67/0 cd |
74/2 e |
75/2 e |
557de |
06/3cd |
61/5c |
f 69/3 |
58 cd |
|
عدم تلقیح |
45/0 a |
68/0 c |
78/2 e |
55/1 f |
135h |
82/1g |
75/2e |
37/3 f |
48 e |
||
|
صفر |
تلقیح |
29/0 c |
54/0 e |
27/1 f |
87/1f |
311g |
41/2f |
59/4 d |
44/3 f |
61 c |
|
|
عدم تلقیح |
36/0 b |
65/0 cd |
30/4d |
87/1f |
312g |
42/2f |
50/4d |
53/4 e |
59 cd |
میانگینهای دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد اختلاف آماری معنادار هستند.
|
|
|
|
A |
B |
|
|
|
|
C |
D |
|
|
|
|
E |
F |
|
|
|
|
G |
H |
|
|
|
|
L |
|
شکل 6 - روابط رگرسیونی بین غلظت کادمیوم در ریشه با خصوصیات حجمتر ریشه (A)، وزنخشک ریشه (B)، چگالی بافت ریشه (C)، وزن تازه ریشه (D)، درصد رطوبت وزنی ریشه (E)، طول ریشه (F)، سطح ریشه (G)، قطر ریشه (H) و چگالی سطح ریشه (L) در گیاه چاودار.
نتیجهگیری کلی
نتیجه این مطالعه نشان داد که کاربرد تریپتوفان و باکتری B. atrophaeus میتوانند باعث کاهش انتقال کادمیوم به اندام هوایی و افزایش تجمع آن در ریشه گیاه چاودار شوند. نتیجه تلفیق کاربرد این دو عامل نتیجه بهتری را نسبت به هر یک از آنها در پی داشت. مطالعه روابط بین ویژگیهای ریشه گیاه چاودار و تجمع کادمیوم در ریشه گیاه نشان داد که بین آنها ارتباط وجود دارد و تیمارهای مورد مطالعه توانستند با اثر بر این ویژگیهای روند جذب کادمیوم را متاثر سازند. برای مطالعات آتی پیشنهاد میگردد از باکتریهای مختلف، غلظتهای مختلف تریپتوفان و سایر گیاهان در این خصوص بهویژه در شرایط مزرعهای استفاده گردد.
سپاسگزاری
به این وسیله از همکاری صمیمانه آزمایشگاههای شیمی، حاصلخیزی و بیولوژی خاک دانشگاه مراغه که مساعدت‌های صمیمانه‌ای در انجام کارهای آزمایشگاهی این مطالعه داشتند، تشکر و قدردانی میگردد.
[1] Root tissue density
[2] Root length
[3] Root surface
[4] Root diameter
[5] Root surface area density
)